繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価
Summary
Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
Abstract
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
Introduction
一次繊毛は、ほとんどの哺乳動物細胞の表面から延びる長い微小管ベースの付属しています。一次繊毛常にセルごとに複数存在し、そのうちの多くの場合、運動性繊毛と混同しており、その目的は、膜の表面を横切って流体を移動させることです。一次繊毛は、対照的に、感覚的役割を採用し、その結果、また感覚繊毛と呼ばれます。いったん長い忘れて、この細胞小器官は、最近、ヒト遺伝病1の多数との会合の結果として「再発見」されました。理想的には、シグナリングオルガネラとして位置付け、一次繊毛は、組織の恒常性と疾患ではなく、開発の2の間だけでなく、重要であるそれらの多くは、多数のシグナル伝達経路を調節することが示されています。
繊毛機能不全に関連することが示され、最初のシグナル伝達経路の一つは、平面内細胞極性（PCP）経路としても知られている非標準Wntシグナル伝達経路、ました<sup > 3。最初にショウジョウバエで同定され、このシグナル伝達カスケードは、胚形成のために重要です。特に収束と拡張のプロセスのために上皮4の平面内での細胞の正しい向きのため。調節タンパク質のコアセットのシーケンシャルシグナル伝達は、最終的に細胞骨格の再編成につながると平面5における上皮細胞の協調分極が生じる方向性の手がかりを変換します。収束と拡張のプロセスは絶対に細長くする蝸 牛管のために、正しい携帯パターニング6のために必要とされます。これはPCP経路の活性化を介して調節されるように、蝸牛のPCP変異体の最も印象的な表現型の一つが無秩序な感覚上皮7に短縮蝸牛管です。正確にこれを調節する方法が解明されないままでも同様に、繊毛を欠くマウス変異体は、また、そのような収束と拡張表現型8,9を示します 。
ve_content ">収束と拡張のプロセスは蝸牛管の伸長、および蝸牛管の中の感覚上皮の細胞パターニングのために重要であるため、開発蝸牛は脊椎動物の開発中にPCPシグナル伝達を検討する中で理想的な器官である。器官コルティ、その行蝸牛管を特殊な感覚上皮に与えられた用語は、一様に10を機能させるには蝸牛のために配向させる必要があり、非感覚支持細胞と機械刺激有毛細胞から構成されている。機械刺激有毛細胞がそのように理由で呼ばれていますクチクラ板から延びるstereociliary束それぞれの感覚有毛細胞11の（先端面）。mechanosensationのと不動としての命名法にもかかわらず、一次トランスデューサとしてこれらの行為は、実際に変更されたアクチンフィラメントベースの微絨毛で構成されている。各山形の髪の中でバンドルは、不動の3行は非常に注文し、定期的なPAで構成されています階段のケース状にttern。実微小管ベースの繊毛、kinociliaは、stereociliary 束 12の開発と方向のために必要とされていると呼ばれます。各有毛細胞の際に、一つの運動毛は、物理的に不動の一番高い行に中央に隣接して位置する、不動毛束に取り付けられています。運動毛の正確な機能は不明である、と1の仮説は、彼らが微絨毛12から成熟するにつれて運動毛が形に不動を「引っ張る」ということです。脊椎動物では、蝸牛内kinociliaは一過性のみ存在し、11,13,14を聞くの開始前にマウスでの有毛細胞から退避。深刻な短縮蝸牛管、誤形成され、誤指向stereociliaryバンドルだけでなく、誤位置付け基礎体8,9の途上蝸牛結果の繊毛の完全な損失。機能的な繊毛はちょうど繊毛軸糸で構成されていません。繊毛に関連した多くのタンパク質機能は、基礎体温、移行帯、または繊毛軸糸15として繊毛関連のサブドメインに局在する複合体で起こります。中心体の母中心小体由来基礎体温は、また、細胞体に繊毛から離れて延びている微小管のための微小管組織化の中心であり、細胞内輸送、ならびに繊毛輸送を調節することができます。毛様体遷移ゾーンは、繊毛機能が毛様体化合物16のインポートおよびエクスポートを整理するのが規制されている別の領域です。
正確なメカニズムは、17不明であるものの、複数の研究は、繊毛および非標準Wnt（PCPシグナリング）との間の接続を確認しています。毛様体およびPCP遺伝子の冗長性と一般化された細胞異常に細胞極性の感度は、それが困難な直接PCP-特定の赤字に変異をリンクすることを可能にします。 PCPシグナル伝達の読み取りアウトの一つは、基礎体温とprimarの位置付けでありますしたがって、2次欠陥から、主なものを分離するのy繊毛は、困難です。ゼブラフィッシュとマウスの変異体におけるいくつかの研究は、18-20シグナリング繊毛およびWnt間の接続を示唆していません。データの矛盾は、種、組織、またはWntシグナル伝達に向かって毛様体の貢献の時間依存性の違いを反映しているのかもしれません。基礎体が機能している場合はさらに、正常なWnt応答性が保持されることがあります。細胞シグナル伝達経路中の毛様体タンパク質の役割をより深く理解し、他の生物学的現象は、細胞および発生生物学の我々の理解のためだけでなく、標的治療戦略の開発のために重要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
分析のための蝸牛組織を調製する場合、心に留めするためのいくつかの重要なポイントがあります。まず、遺伝的背景の違いは、それが必要なだけ同腹のコントロールを分析し、比較すること、蝸牛の表現型を変更することができます。第二に、被蓋膜の完全な除去は、免疫組織化学で最高の画像を得るために必要とSEMのために必須です。被蓋膜は不透明構造であり、イメージングがより困?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はマシュー・ケリー、ティツィアーナCogliati、ジェシカGumerson、ウーヴェウォルフルム、Rivkaルブロン、ヴィオラクレッチマーとゾーイマンに感謝し、原稿の彼らの重要な評価のためにしたいと思います。この作品は、Sofjaコワレフスカヤ賞（Humbodlt財団）とヨハネス・グーテンベルク大学マインツ、ドイツによって賄われていました。
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
| Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
| Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
| Dissecting microscope. | Various | ||
| Uncoated glass microscope slides | Various | ||
| Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
| Transfer pipettes | Various | ||
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
| Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
| PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
| Fluorescent Microscope | Various | ||
| Critical Point Dryer | Various | ||
| Scanning Electron Microscope | Various | ||
| Glass microscope slides | Various | ||
| Glass coverslips | Various | ||
| Kimwipe Tissue | Various | ||
| Fine Paint Brush | |||
| Reagents | |||
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
| Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
| 2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
| NaCl | Various | ||
| CaCl 2 | Various | ||
| Triton X-100 | Various | ||
| Normal Goat Serum | Various | ||
| AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
| Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
| Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Ethanol 200 proof | Various | ||
| Antibodies | |||
| anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
| anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
| anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
| anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
| Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
| Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
| anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
| anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
| Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
| Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |
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