Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
Primære cilia er lange mikrotubul-baserte vedheng som strekker seg fra overflaten av de fleste pattedyrceller. Primær cilia forveksles ofte med motile flimmerhårene, som det alltid er flere pr celle, og hvis formål er å bevege fluidet på tvers av membranoverflatene. Primær flimmerhårene, i motsetning, vedta sensoriske roller og er følgelig også referert til som sensorisk flimmerhårene. Når lenge glemt, dette organ har nylig blitt "gjenoppdaget" som et resultat av sin tilknytning til et mangfold av menneskelige genetiske sykdommer 1. Ideelt plassert som en signalorganelle, har det primære cilium blitt vist å regulere en rekke signalveier, hvorav mange er viktig ikke bare i vev homeostase og sykdommer, men også under utvikling to.
En av de første signalveier er vist å være forbundet med cilia dysfunksjon var den ikke-kanonisk Wnt signalveien, også kjent som den plane celle polaritet (PCP) pathway <sup > 3. Denne signalkaskade først identifisert i Drosophila, er kritisk for embryogenese; spesielt for konvergens og forlengelse prosesser og for den korrekte orientering av celler i planet av epitel 4. Den sekvensielle signalisering av en kjerne satt av regulatoriske proteiner settes retningsbestemte signaler som til slutt fører til cytoskeletal omordninger og resultere i den koordinerte polarisasjonen av epitel-celler i et plan 5. Prosessen med konvergens og forlengelse er absolutt nødvendig for cochlea kanalen langstrakt og for riktig cellulær mønster 6. Ettersom dette er regulert via aktivering av PCP-reaksjonsveien, er en av de mest slående fenotypene av cochlea PCP mutanter et forkortet cochlea kanal med uorganisert sensorisk epithelia 7. Tilsvarende mus mutanter, som mangler flimmerhårene, også oppvise en slik konvergens og forlengelse fenotype 8,9, men nøyaktig hvordan dette er regulert gjenstår å bli belyst.
ve_content "> Fordi konvergens og forlengelses prosesser er avgjørende for utvekst av sneglehuset duct, og cellulær mønster av sensorisk epitel i cochlea kanalen, er den tredje cochlea et ideelt organ der å undersøke PCP signale under virveldyr utvikling. Orgelet av Corti, betegnelsen på den spesialiserte sensorisk epitel som linjer cochleakanalen, består av ikke-sanse støtte celler og mechanosensory hårceller som må være jevnt orientert for sneglehuset skal fungere 10. de mechanosensory hårcellene er så kalt på grunn av stereociliary bunter som strekker seg fra cuticular plate (apikale overflaten) av hver sanse hår celle 11. Disse fungerer som primær transdusere av mechanosensation og til tross for sin nomenklatur som stereocilia, faktisk består av modifiserte aktin filament-baserte microvilli. Innenfor hver vinkelformet hår bunt, blir tre rader med stereocilia organisert på en meget ordnet og regulert pattern i en trapp sak-lignende måte. Ekte microtubule baserte flimmerhårene, betegnes kinocilia, er nødvendig for utvikling og orientering av stereociliary bunter 12. Ved hvert hår cellen, blir en enkelt kinocilium fysisk festet til stereocilia bunten, som ligger sentralt i tilknytning til den høyeste rekke av stereocilia. Den nøyaktige funksjonen til kinocilium er uklart, og en hypotese er at kinocilium "trekker" den stereocilia i form som de modnes fra microvilli 12. I virveldyr, kinocilia i sneglehuset er bare til stede forbigående og trekke fra hårcellene i mus før utbruddet av å høre 11,13,14.Fullstendig tap av flimmerhårene i utviklings cochlea resulterer i alvorlig forkortede cochlea kanaler, mis-formet og mis-orientert stereociliary bunter, samt mis-plassert basal organer 8,9. En funksjonell cilium er ikke bare består av ciliary axoneme. Mange proteiner forbundet med ciliafunksjon oppstå i komplekser lokalisert til cilia-relaterte underdomener som basal kropps, overgangssone, eller ciliare axoneme 15. Den basale kropps, avledet fra moren centriole av sentrosomen, er også en mikrotubuli-organiserende senter for mikrotubuli som strekker seg bort fra cilium inn i cellelegemet og kan regulere intracellulær handelen, så vel som ciliare handel. Ciliary overgangssone er et annet område hvor stråle funksjon er regulert i form av organisering import og eksport av ciliary forbindelser 16.
Flere studier har identifisert en sammenheng mellom flimmerhårene og ikke-kanoniske Wnt (PCP signal), selv om den nøyaktige mekanismen er uklar 17. Redundans av ciliare og PCP gener og følsomheten av cellen polaritet til genercelleforandringer, gjør det vanskelig å direkte koble en mutasjon til PCP-spesifikke underskudd. En av de leste ut av PCP signalering er plasseringen av basal legemet og Primary cilium derfor segregerende primær fra sekundærskader er utfordrende. Noen studier i sebrafisk og mus mutanter har antydet noen forbindelse mellom flimmerhårene og Wnt signale 18-20. Avvik i dataene kan gjenspeile arter, vev, eller temporal-avhengige forskjeller i ciliary bidrag til Wnt signalering. Videre kan normalt Wnt respons beholdes hvis basale kropper forbli funksjonelle. En dypere innsikt i rollen som ciliary proteiner i cellulære signalveier og andre biologiske fenomener er avgjørende for vår forståelse av cellulære og utviklingsbiologi, samt for utvikling av målrettede behandlingsstrategier.
Når du forbereder cochlea vev for analyse, er det noen viktige punkter å huske på. For det første, kan forskjeller i genetisk bakgrunn endre cochlea fenotype, noe som gjør det nødvendig å analysere og sammenligne bare kullbror kontroller. Dernest er fullstendig fjerning av tectorial nødvendig for å oppnå de beste bildene med immunhistokjemi og er avgjørende for SEM. Den tectorial er en ugjennomsiktig struktur og kan skjule cellene i sensorisk epitel rett under den, slik bildebehandling mer utfordrende. Av og …
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren ønsker å takke Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer og Zoe Mann og for deres kritisk vurdering av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Sofja Kovalevskaya Award (Humbodlt Foundation) og Johannes-Gutenberg-universitetet, Mainz, Tyskland.
Tools/Equipment | |||
Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
Dissecting microscope. | Various | ||
Uncoated glass microscope slides | Various | ||
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
Transfer pipettes | Various | ||
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
Fluorescent Microscope | Various | ||
Critical Point Dryer | Various | ||
Scanning Electron Microscope | Various | ||
Glass microscope slides | Various | ||
Glass coverslips | Various | ||
Kimwipe Tissue | Various | ||
Fine Paint Brush | |||
Reagents | |||
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
NaCl | Various | ||
CaCl 2 | Various | ||
Triton X-100 | Various | ||
Normal Goat Serum | Various | ||
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Ethanol 200 proof | Various | ||
Antibodies | |||
anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |