핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성
Summary
여기에서 우리는 핵소체 조직을 기반으로 마우스의 전 정부 난자의 특성에 대한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.
Introduction
난소 전 정부 구획실로부터 분리 전 정부 완전히 자란 난자 (GV, 새싹 소포)는 일상적 같은 다른 목적을 위해 사용되는 예를 들면, 중기 II 단계까지 시험 관내 성숙 뒤에 분자 세포 메카니즘의 연구.
그들의 아름다운 외관에도 불구하고 대부분의 전 정부 난자, 전부는 아니지만, 감수 분열을 완료하고 포배기에 도달 할 수있다; 시비 3-5 발생할 경우 실제로 인간 1,2- 포함한 많은 포유류 종에서, 이들 중 약 30 %, 2 단계에서 셀들이 개발 체포. 현재까지, 몇몇 파라미터는 그렇게 할 수없는 것과 배아 발달을 유지할 수 난자를 구별하기 위해 사용된다.
예를 들어, 크레 실 블루 염색 (BCB)은 BCB + 또는 BCB- 염색 관련이 정렬 방법의 유용성이 있지만 글루코오스 -6- 포스페이트 탈수소 효소의 활성에 기초하여 난자를 정렬하는 방법으로서 유효한여전히 6-8 의존 실험실.
또 다른 잘 확립 된 방법은 염색질 조직에있는 (Hoechst33342 같은) 어떤 DNA의 인터 염료로 염색하는 경우, 전 정부 난자의 70 %가 핵소체 주위에 염료 긍정적 인 반지를 보여 핵소체 (SN)를 둘러싸인라고 30 %를 유지하면서 더 발견 긍정적 인 신호를 보여주고 (NSN) 3-5하지 둘러싸인 핵소체라고합니다. 최근에 우리는 보여 주었다 세포질 그릴 (9) (CPLS, 포유류의 난자와 배아 모두 모계 유래의 mRNA와 리보솜에 중요한 저장 사이트)의 부재 (10)의 존재와 함께 (CPLS 형성 (11)에 대한 필수) 이잖아요의 하향 조절, 그들의 세포질 9,12- 지질 방울, 2 세포 단계 이상으로 진행 NSN 난자의 무능력과 관련된 다른 원인이 될 수 있습니다.
불행하게도, 몇몇 기술은 전 정부 SN과 NSN의 난자와 정렬을 적용 할 수 있습니다,이러한 이유로, (핵 염색, 정착 절차 또는 입 피펫으로 조작없이) 덜 침습적 방법의 개발이 모두 인간과 동물의 배아 발달의 속도를 높이기 위해 매우 중요해질 수있다.
본 논문에서는 세부 간단하고 빠른 프로토콜은 광고 정렬 SN과 여성의 생쥐에서 NSN 전 정부 난자를 격리하는 데 사용됩니다 그것은 여성 배우자, 난자의 성숙과 배아 개발의 연구에 관심이있는 모든 과학자들에게 해결됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 분리 및 마우스 전 정부 GV 난자를 분류하기 위해 사용 된 방법을 설명한다. 몇 가지 예외를 제외하고, 밑줄 특별히 중요한 단계가 없습니다. ) 난자의 활력을 유지하고 b)에 사용되는 배지에서 pH 변화를 방지 : 첫째 :이 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 둘째 : 난자는 IVM과 체외 수정은 다음 단계는 특히, 염색질 손상 및 난자의 후속 죽음을 피하기 위해 Hoechst33342에 (5 ~ 10 초) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.
Materials
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
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