عزل وتوصيف ماوس الغارية البويضات واستنادا إلى منظمة ونين نويي
Summary
هنا نقدم بروتوكول لتوصيف البويضات غاري الماوس على أساس تنظيم نويي.
Abstract
This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.
Introduction
وتستخدم غاري البويضات نمت بشكل كامل (GV، الحويصلة الجرثومية) معزولة عن مقصورة الغارية من المبيض بشكل روتيني لأغراض مختلفة مثل، على سبيل المثال، ودراسة الآليات الجزيئية والخلوية وراء في المختبر النضج حتى مرحلة الطورية II.
وعلى الرغم من ظهور البويضات الأكثر الغارية جميلة، ولكن ليس كل شيء، هي قادرة على استكمال الانقسام الاختزالي والوصول إلى مرحلة الكيسة الأريمية. في الواقع، في كثير من أنواع الثدييات، بما في ذلك البشر 1،2، ما يقرب من 30٪ منهم تعتقل تنميتها في المرحلة 2-الخلية، في حالة حدوث الإخصاب 3-5. حتى الآن، تستخدم بعض المعلمات للتمييز بين البويضات قادرة على الحفاظ على التطور الجنيني من أولئك الذين لا يستطيعون القيام بذلك.
على سبيل المثال، الكريزيل تلطيخ الأزرق (BCB) هو وسيلة صالحة لفرز البويضات على أساس النشاط الجلوكوز 6 فوسفات نازعة-على الرغم من أن فائدة هذه الطريقة فرز المتعلقة BCB + أو تلطيخ BCB- هيلا يزال المختبرات تعتمد 6-8.
يوجد طريقة أخرى راسخة في المؤسسة لونين بها: إذا ملطخة أي الأصباغ الإقحام الحمض النووي (مثل Hoechst33342)، و 70٪ من البويضات الغارية تظهر حلقة صبغ إيجابي حول نوية وتسمى تحيط نوية (SN) في حين أن 30٪ المتبقية تظهر إشارات إيجابية أكثر رصدت وتسمى ليس تحيط نوية (NSN) 3-5. أظهرنا مؤخرا أن غياب السياج حشوية 9 (CPLs، مواقع تخزين هامة لمرنا وريبوسوم المستمدة أمهات في كل من البويضات في الثدييات والأجنة) (10) وأسفل تنظيم MATER (ضروري لتشكيل CPLs 11)، جنبا إلى جنب مع وجود قطرات الدهون في cytoplasms من 9،12، يمكن أن يكون لأسباب أخرى تتعلق البويضات عدم NSN المضي قدما إلى ما بعد مرحلة 2-الخلية.
للأسف، عدد من التقنيات يمكن تطبيقها على فرز SN الغار والبويضات NSN و،لهذا السبب، يمكن تطوير أسلوب أقل الغازية (دون تلطيخ النووي، إجراءات تثبيت أو التلاعب مع ماصات الفم) أصبحت مهمة جدا لزيادة معدلات كلا تطور الجنين الإنسان والحيوان.
في هذه الورقة، ونحن بالتفصيل بروتوكول بسيطة وسريعة تستخدم لعزل الإعلان نوع SN وNSN البويضات الغارية من إناث الفئران وموجهة الى جميع العلماء المهتمين في دراسة عملية تكوين الأمشاج الإناث، نضوج البويضة وتطور الجنين.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول الطريقة المستخدمة لعزل وتصنيف الماوس غاري البويضات GV. لا توجد خطوات حاسمة خاصة أن نؤكد، مع استثناءات قليلة. أولا: يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء في أسرع وقت ممكن بما يلي: أ) الحفاظ على حيوية البويضات وب) تجنب التغييرات درجة الحموضة في الوسيلة المستخدم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.
Materials
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
