Выделение и характеристика Mouse антрального ооцитов на основе организации хроматина ядрышка
Summary
Здесь мы приводим протокол для характеристики мыши антральных ооцитов, основанных на ядрышек организации.
Abstract
This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.
Introduction
Антральных полностью выращенные ооциты (GV, зародышевый пузырек), выделенные из антрального отделения яичника обычно используются для различных целей, таких как, например, изучение молекулярных и клеточных механизмов за созревание в пробирке до стадии II Метафаза.
Несмотря на их красивый внешний вид наиболее антральных ооцитов, но не все, могут завершить мейоза и достичь стадии бластоцисты; В самом деле, во многих видов млекопитающих, включая человека 1,2, примерно 30% из них задержать их развитие на этапе 2-клеточной, если происходит оплодотворение 3-5. На сегодняшний день, несколько параметров используются для различения между ооцитов, способных выдержать эмбрионального развития от тех, кто не сделать.
Например, Cresyl синий окрашивание (BCB) является допустимым методом для сортировки ооциты на основе активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, хотя-полезность этого метода сортировки, связанные с BCB + или BCB- окрашиванияпо-прежнему зависит 6-8 лаборатория.
Другой хорошо признанным методом заключается в их организации хроматина: если окрашивали либо интеркалирующих ДНК красителей (как Hoechst33342), 70% из антральных ооцитов показать кольцо красителя-положительных вокруг ядрышка и называются окружении ядрышка (SN), а оставшиеся 30% показать более пятнистых позитивные сигналы и называются не окружены Ядрышка (NSN) 3-5. Недавно мы показали, что отсутствие цитоплазматических решеток 9 (CPLS, важных мест хранения матерински полученных мРНК и рибосом в обоих ооцитов млекопитающих и эмбрионов) 10 и вниз регулирование MATER (важно для формирования CPLS 11), вместе с наличием липидов капли в цитоплазме их 9,12, могут быть и другие причины, связанные с невозможностью ооцитов NSN, чтобы продолжить за пределы стадии 2-клеток.
К сожалению, мало методы могут быть применены для сортировки антрального SN и NSN ооцитов и,по этой причине, развитие менее инвазивных методов (без ядерного окрашивания, процедуры фиксации или манипуляции с рот пипетками) может стать очень важно повысить ставки как эмбрионального развития человека и животных.
В этой статье мы подробно простой и быстрый протокол, используемый для выделения объявления сортировки SN и NSN антральных ооцитов из самок мышей и оно адресовано всем заинтересованным ученым в изучении женской гаметы, созревание яйцеклетки и развития зародыша.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод, используемый, чтобы изолировать и классифицировать мыши антральных GV ооцитов. Там нет особых важных шагов, чтобы подчеркнуть, с несколькими исключениями. Во-первых: эта процедура должна быть выполнена как можно быстрее, чтобы: а) поддерживать жизнеспособ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.
Materials
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
