Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione
Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di oociti antrali di topo sulla base di organizzazione nucleolare.
Abstract
This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.
Introduction
Antrale ovociti completamente sviluppati (GV, vescicola germinale) isolati dal vano antrale dell'ovario sono abitualmente utilizzati per scopi diversi, come, per esempio, lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari alla base maturazione in vitro fino metafase II.
Nonostante le loro bella apparenza oociti antrali più, ma non tutti, sono in grado di completare la meiosi e raggiungere lo stadio di blastocisti; infatti, in molte specie di mammiferi, compreso l'uomo 1,2, circa il 30% del loro arresto loro sviluppo nella fase 2 cellule, se avviene la fecondazione 3-5. Ad oggi, alcuni parametri sono utilizzati per distinguere tra gli ovociti in grado di sostenere lo sviluppo embrionale da quelli in grado di farlo.
Ad esempio, cresolo colorazione blu (BCB) è un valido metodo per ordinare gli ovociti basati sull'attività di glucosio-6-fosfato deidrogenasi, sebbene l'utilità di questo metodo di ordinamento correlate a BCB + o colorazione è BCB-ancora dipendente 6-8 laboratorio.
Un altro metodo consolidato risiede nella loro organizzazione della cromatina: se macchiata di eventuali coloranti intercalanti del DNA (come Hoechst33342), il 70% degli ovociti antrali mostrano un anello colorante positivo attorno al nucleolo e sono chiamati Circondato Nucleolo (SN), mentre il restante 30% mostrare un segnali positivi più maculati e sono chiamate Non Circondato Nucleolo (NSN) 3-5. Recentemente abbiamo dimostrato che l'assenza di reticoli citoplasmatici 9 (CPL, siti di stoccaggio importanti per mRNA di origine materna e ribosomi sia in ovociti di mammiferi ed embrioni) 10 e la down-regolazione di MATER (essenziale per CPL formazione 11), unitamente alla presenza di gocce lipidiche nei loro cytoplasms 9,12, possono essere altre cause legate alla ovociti incapacità NSN a procedere oltre la fase 2 cellule.
Purtroppo, poche tecniche possono essere applicate per ordinare SN antrale e oociti NSN e,per questa ragione, lo sviluppo di un metodo meno invasivo (senza colorazione nucleare, le procedure di fissaggio o di manipolazione con pipette bocca) potrebbe diventare molto importante aumentare i tassi di entrambi sviluppo embrionale umano e animale.
In questo lavoro, abbiamo dettaglio il protocollo semplice e veloce utilizzato per isolare annuncio sorta SN e NSN oociti antrali di topi di sesso femminile e si rivolge a tutti gli scienziati interessati allo studio della gametogenesi femminile, la maturazione degli ovociti e sviluppo embrionale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive il metodo utilizzato per isolare e classificare il mouse antrali GV ovociti. Non vi sono particolari passaggi critici per sottolineare, con poche eccezioni. Primo: questa procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile: a) mantenere la vitalità degli ovociti e b) evitare variazioni di pH del mezzo utilizzato. Secondo: gli ovociti devono essere brevemente eccitato (5-10 sec) per Hoechst33342 per evitare danni cromatina e la successiva morte degli ovociti, soprattutto se IVM e IVF …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.
Materials
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
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