Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina
Summary
Aqui apresentamos um protocolo para a caracterização de oócitos antrais de rato com base na organização nucleolar.
Abstract
This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.
Introduction
Antrais oócitos GV (totalmente crescidas, vesícula germinal) isolados a partir do compartimento do antro do ovário são rotineiramente usadas para diferentes fins, tais como, por exemplo, no estudo dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes a maturação in vitro até estádio de metáfase II.
Apesar de suas aparência bonita oócitos mais antrais, mas não todos, são capazes de completar a meiose e atingir o estágio de blastocisto; De facto, em muitas espécies de mamíferos, incluindo seres humanos 1,2, cerca de 30% deles deter o seu desenvolvimento na fase de 2 células, se ocorre a fertilização 3-5. Até à data, alguns parâmetros são usados para distinguir entre oócitos capazes de sustentar o desenvolvimento embrionário de pessoas incapazes de fazê-lo.
Por exemplo, coloração com azul de Cresyl (BCB) é um método válido para classificar os oócitos com base na actividade da glucose-6-fosfato-desidrogenase, embora a utilidade deste método de classificação relacionada com BC + ou coloração é BCB-Ainda laboratório dependentes 6-8.
Outro método bem estabelecido reside na sua organização da cromatina: se coradas com quaisquer corantes intercalantes de ADN (como Hoechst33342), 70% dos oócitos antrais mostrar um anel de corante-positiva em torno do núcleo e são chamados rodeado nucléolo (SN), enquanto que os restantes 30% mostrar um mais manchado sinais positivos e são chamados Não Rodeado nucléolo (NSN) 3-5. Recentemente, mostrou que a ausência de reticulados citoplasmáticos 9 (CPLs, locais de armazenagem importantes para ARNm de origem materna e ribossomas em ambos os oócitos de mamíferos e embriões) 10 e a sub-regulação de MATER (essencial para a formação CPLs 11), juntamente com a presença de gotículas lipídicas em seus citoplasmas 9,12, pode haver outras causas relacionadas com a incapacidade NSN oócitos de proceder para além do estádio de 2 células.
Infelizmente, algumas técnicas podem ser aplicadas para classificar SN antral e oócitos e NSN,Por esta razão, o desenvolvimento de um método menos invasivo (sem coloração nuclear, os processos de fixação ou manipulação com pipetas de boca) pode tornar-se muito importante para aumentar as taxas de desenvolvimento embrionário, tanto humana e animal.
Neste artigo, detalhamos o protocolo simples e rápida usada para isolar anúncio SN tipo e NSN oócitos antrais de camundongos fêmeas e é dirigida a todos os cientistas interessados no estudo da gametogênese do sexo feminino, a maturação eo desenvolvimento do embrião.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve o método usado para isolar e classificar rato antrais oócitos GV. Não há passos críticos particular, sublinhar, com poucas exceções. Primeiro: este procedimento deve ser realizado o mais rapidamente possível: a) manter a vitalidade dos oócitos e b) evitar mudanças de pH no meio utilizado. Segunda: oócitos deve ser animado brevemente (5-10 s) a Hoechst33342 para evitar danos da cromatina e a posterior morte dos oócitos, especialmente se IVM e FIV são os seguintes passos. Até à data,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.
Materials
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
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