Isolering og karakterisering af muse Antral Oocyter Baseret på nucleolar chromatin Organization
Summary
Her præsenterer vi en protokol til karakterisering af muse antral oocytter baseret på nucleolar organisation.
Abstract
This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.
Introduction
Antrale fuldvoksne oocytter (GV, kimblære) isoleret fra antrale rum i æggestokkene rutinemæssigt anvendes til forskellige formål, såsom for eksempel undersøgelse af de molekylære og cellulære mekanismer bag in vitro modning Til Metafase II fase.
På trods af deres smukke udseende mest antrale oocytter, men ikke alle, er i stand til at fuldføre meiose og nå blastocyst-stadiet; faktisk i mange pattedyrarter, herunder mennesker 1,2, ca. 30% af dem standse deres udvikling ved 2-celle stadiet, hvis befrugtning sker 3-5. Til dato anvendes få parametre til at skelne mellem oocytter stand til at opretholde den embryoniske udvikling fra dem i stand hertil.
For eksempel Cresyl blåfarvning (BCB) er en gyldig metode til at sortere oocytter baseret på aktiviteten af glucose-6-phosphat dehydrogenase skønt anvendeligheden af denne sorteringsmetode relateret til BCB + eller BCB- farvningen erstadig laboratorium afhængige 6-8.
En anden veletableret metode ligger i deres kromatin organisation: hvis farves med eventuelle DNA-interkalerende farvestoffer (som Hoechst33342), 70% af antrale oocytter viser et farvestof-positiv ring omkring nucleolus og kaldes Omgivet nucleolus (SN), mens de resterende 30% viser en mere plettet positive signaler og kaldes Ikke Omgivet nucleolus (NSN) 3-5. For nylig viste vi, at fraværet af cytoplasmatiske gitre 9 (cpls, vigtige lagringssteder for maternelle mRNA og ribosomer i både pattedyr oocyter og embryoner) 10 og nedregulering af MATER (afgørende for cpls dannelse 11), sammen med tilstedeværelsen af lipiddråber i deres cytoplasmaer 9,12, kan være andre årsager i forbindelse med NSN oocytter manglende evne til at gå ud over den 2-celle stadiet.
Desværre kan få teknikker anvendes til at sortere antral SN og NSN oocyter ogaf denne grund, kan udviklingen af en mindre invasiv metode (uden nuklear farvning, fikseringen eller manipulation med munden pipetter) bliver meget vigtigt at øge satserne for både udvikling af menneskelige og dyrs foster.
I dette papir, vi detalje den enkle og hurtige protokol, der bruges til at isolere annonce sortere SN og NSN antrale oocytter fra hunmus, og den er rettet til alle de forskere interesseret i studiet af kvindelige gametogenese, oocytmodning og udvikling foster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver den anvendte metode til at isolere og klassificere musen antrale GV oocytter. Der er ingen særlige kritiske skridt til at understrege, med få undtagelser. Første: Denne procedure skal udføres så hurtigt som muligt til: a) at bevare vitaliteten af oocytter og b) at undgå pH-ændringer i mediet anvendes. Andet: oocytter skal være kortvarigt ophidset (5-10 sek) til Hoechst33342 at undgå kromatin skader og efterfølgende død af oocytter, især hvis IVM og IVF er følgende trin. Til da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.
Materials
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
