Summary

Nucleolar Chromatin संगठन के आधार पर माउस कोटरीय oocytes के अलगाव और विशेषता

Published: January 07, 2016
doi:

Summary

यहाँ हम nucleolar संगठन के आधार पर माउस कोटरीय oocytes के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Abstract

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.

Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.

Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Introduction

अंडाशय के कोटरीय डिब्बे से अलग कोटरीय पूर्ण विकसित oocytes (जीवी, कीटाणु पुटिका) नियमित रूप से इस तरह के रूप में विभिन्न प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, मेटाफ़ेज़ द्वितीय चरण तक इन विट्रो परिपक्वता के पीछे आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन।

उनके सुंदर दिखने के सबसे कोटरीय oocytes के बावजूद, लेकिन सभी नहीं, अर्धसूत्रीविभाजन को पूरा करने और ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुंचने के लिए सक्षम हैं; निषेचन 3-5 होती है, तो वास्तव में, मनुष्य 1,2 सहित कई स्तनधारी प्रजातियों में, उनमें से लगभग 30%, 2 सेल मंच पर उनके विकास को गिरफ्तार। तिथि करने के लिए, कुछ मापदंडों ऐसा करने में असमर्थ उन से भ्रूण के विकास को बनाए रखने के लिए सक्षम oocytes के बीच भेद करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

उदाहरण के लिए, cresyl नीले धुंधला (बीसीबी) बीसीबी + या BCB- धुंधला से संबंधित इस छँटाई विधि की उपयोगिता है, हालांकि ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि के आधार पर oocytes सुलझाने के लिए एक वैध तरीका हैअभी भी 6-8 निर्भर प्रयोगशाला।

एक और अच्छी तरह से स्थापित विधि उनकी क्रोमेटिन संगठन में रहता है: (Hoechst33342) की तरह किसी भी डीएनए intercalating रंगों के साथ दाग, तो कोटरीय oocytes की 70% न्यूक्लियस के चारों ओर एक डाई सकारात्मक अंगूठी दिखाने के लिए और न्यूक्लियस (एस एन) घिरा कहा जाता है 30%, जबकि शेष एक अधिक देखा सकारात्मक संकेतों दिखाने के लिए और (NSN) 3-5 नहीं घिरा न्यूक्लियस कहा जाता है। हाल ही में हमने दिखाया कि साइटोप्लास्मिक lattices 9 (CPLS, स्तनधारी oocytes और भ्रूण दोनों में माता के रूप में ली गई mRNA और राइबोसोम के लिए महत्वपूर्ण भंडारण साइटों) के अभाव में 10 और की उपस्थिति के साथ एक साथ (CPLS गठन 11 के लिए आवश्यक) विद्यालय के नीचे विनियमन, उनकी cytoplasms 9,12 में लिपिड बूंदों, 2-सेल चरण से आगे बढ़ने के लिए NSN oocytes अक्षमता से संबंधित अन्य कारणों से हो सकता है।

दुर्भाग्य से, कुछ तकनीकों कोटरीय एस.एन. और NSN oocytes और सुलझाने के लिए लागू किया जा सकता है,इस कारण के लिए, (परमाणु धुंधला, निर्धारण प्रक्रियाओं या मुंह pipettes साथ हेरफेर के बिना) एक कम इनवेसिव विधि का विकास दोनों मानव और पशुओं के भ्रूण के विकास की दरों में वृद्धि करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है।

इस पत्र में, हम विस्तार से सरल और त्वरित प्रोटोकॉल विज्ञापन प्रकार एस.एन. और मादा चूहों से NSN कोटरीय oocytes को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया और यह महिला gametogenesis, डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता और भ्रूण के विकास के अध्ययन में रुचि रखने वाले सभी वैज्ञानिकों को संबोधित किया है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल यूरोपीय के मार्गदर्शक सिद्धांत (ईयू 63/2010) और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए इस्तेमाल जानवरों की रक्षा इतालवी (26/2014) कानूनों के अनुसार आयोजित किया जाता है। सरवाइकल अव्यवस्था इच्छामृत्यु अंडाशय अलगाव के ?…

Representative Results

निम्नलिखित चित्र Hoechst33342 के माध्यम से oocytes 'छँटाई करने के लिए pipettes तैयारी से शुरू, माउस अंडाशय से कोटरीय oocytes को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया विधि दिखा। यह पद्धति काफी सरल है और सीओ 2 इनक्य…

Discussion

इस प्रोटोकॉल को अलग और माउस कोटरीय जीवी oocytes वर्गीकृत करने के लिए प्रयोग किया जाता विधि का वर्णन है। कुछ अपवादों के साथ, रेखांकित करने के लिए कोई विशेष महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। क) oocytes की जीवन शक्ति को बनाए …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.

Materials

PMSG Sigma G4527
EmbrioMax M2 Millipore MR-015-PD
Hoechst33342 Thermo Scientific 62249
Mineral Oil Sigma M8410
Cell Culture Dish 35mmx10mm Corning 430165
µ-Dish 35mm, high glass bottom Ibidi 81158
Pipette Pasteur Borosilicate Corning 7095D-9
Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes Sigma A5177

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Cite This Article
Monti, M., Redi, C. A. Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization. J. Vis. Exp. (107), e53616, doi:10.3791/53616 (2016).

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