Isolering och karakterisering av mus Antral oocyter Baserat på Nukleolärt Chromatin Organization
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för karakterisering av mus antrala oocyter baserade på nukleolär organisation.
Abstract
This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.
Introduction
Antrala fullvuxna oocyter (GV, germinal vesikel) isolerade från antral utrymmet i äggstocken används rutinmässigt för olika ändamål, såsom, till exempel, studier av de molekylära och cellulära mekanismerna bakom in vitro-mognad to Metaphase II stadium.
Trots deras vackra utseende mest antral ägg, men inte alla, har möjlighet att slutföra meios och nå blastocyststadiet; i själva verket i många däggdjursarter, inklusive människor 1,2, ungefär 30% av dem gripa deras utveckling vid 2-cellstadiet, om befruktning sker 3-5. Hittills har några parametrar som används för att skilja mellan äggceller kunna upprätthålla den embryonala utvecklingen från de som inte kan göra det.
Till exempel är Cresyl blåfärgning (BCB) en giltig metod för att sortera oocyterna baserade på aktiviteten av glukos-6-fosfat-dehydrogenas fastän användbarheten av denna sorteringsmetod relaterat till BCB + eller BCB- färgningen ärfortfarande beroende 6-8 laboratorium.
En annan väl etablerad metod ligger i deras kromatin organisation: om färgas med någon DNA interkalerande färgämnen (som Hoechst33342), 70% av antral oocyter visar en färg positiv ring runt kärnsystemet och kallas Omgiven kärnsystemet (SN), medan resterande 30% visar en mer prickiga positiva signaler och kallas inte Omgiven kärnsystemet (NSN) 3-5. Nyligen visade vi att frånvaron av cytoplasmiska gitter 9 (CPLS, viktiga lagringsplatser för maternella mRNA och ribosomer i både däggdjurs oocyter och embryon) 10 och nedreglering av MATER (väsentliga för cpls formation 11), tillsammans med förekomsten av lipiddroppar inom sina cytoplasmor 9,12, kan finnas andra orsaker relaterade till NSN oocyter oförmåga att fortsätta bortom två-cellstadiet.
Tyvärr kan några tekniker användas för att sortera antral SN och NSN ägg ochAv denna anledning, kan utvecklingen av en mindre invasiv metod (utan nukleär färgning, fixeringsförfaranden eller manipulation med mun pipetter) blir mycket viktigt att öka andelen både människors och djurs embryoutveckling.
I detta papper, vi detalj snabbt och enkelt protokoll som används för att isolera annons sortera SN och NSN antral oocyter från honmöss och det riktar sig till alla de forskare som är intresserade av att studera kvinnliga gametogenes, oocytmognad och embryoutveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver den metod som används för att isolera och klassificera mus antrala GV-oocyter. Det finns inga särskilda viktiga steg för att understryka, med några få undantag. Först: denna procedur bör utföras så snabbt som möjligt för att: a) upprätthålla livskraften i oocyterna och b) att undvika pH-förändringar i det medium som används. För det andra: oocyter bör vara kort upphetsad (5-10 sek) till Hoechst33342 att undvika kromatin skador och efterföljande död oocyterna, särskilt om I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.
Materials
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
