فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح
Summary
وتستخدم على نطاق واسع النهج علم البصريات الوراثي للتلاعب النشاط العصبي وتقييم النتائج المترتبة على وظيفة الدماغ. هنا، ويرد الاسلوب الذي عليها في الجسم الحي التعبير عن منشط البصرية Channelrhodopsin، ويسمح لخارج الجسم الحي تحليل خصائص متشابك بعيدة المدى محددة والوصلات العصبية المحلية في الدوائر ذات الصلة الخوف.
Abstract
وتستخدم نهج علم البصريات الوراثي الآن على نطاق واسع لدراسة وظيفة من السكان العصبي ودوائر عن طريق الجمع بين التعبير التي تستهدف تنشيط البروتينات الخفيفة والتلاعب لاحق من النشاط العصبي من الضوء. Channelrhodopsins (س.) هي قنوات الموجبة بوابات الخفيفة وعندما تنصهر لبروتين فلوري التعبير عنها يسمح لتصور وتفعيل المتزامن لأنواع معينة من الخلايا والتوقعات محور عصبي في مناطق محددة من الدماغ. عن طريق الحقن المجسم من النواقل الفيروسية، والبروتينات الانصهار مركز حقوق الانسان يمكن التعبير عنها بشكل جوهري أو مشروط في خلايا معينة من منطقة في الدماغ تعرف، ويمكن بعد ذلك التوقعات محواري على دراستها تشريحيا ووظيفيا عبر فيفو السابقين تفعيل علم البصريات الوراثي في شرائح الدماغ. هذا الأمر أهمية خاصة عندما تهدف إلى فهم خصائص متشابك من الاتصالات التي لا يمكن تناولها مع النهج التحفيز الكهربائي التقليدية، أو في تحديد affe روايةالإيجار والربط صادر الذي كان متصورا سيئة. هنا، بعض الأمثلة لتوضيح كيفية هذه التقنية يمكن تطبيقها على التحقيق في هذه الأسئلة لتوضيح الدوائر ذات الصلة خوف في اللوزة. اللوزة هي منطقة رئيسية لاكتساب والتعبير عن الخوف، وتخزين الخوف والذكريات العاطفية. العديد من خطوط الأدلة تشير إلى أن قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) تشارك في جوانب مختلفة من اكتساب الخوف والانقراض، ولكن الربط الدقيق مع اللوزة هو مجرد بداية ليكون مفهوما. أولا، فإنه يظهر كيف فيفو السابقين تفعيل علم البصريات الوراثي يمكن استخدامها لدراسة جوانب الاتصالات متشابك بين afferents mPFC والخلايا المستهدفة في اللوزة basolateral (جيش تحرير بلوشستان). وعلاوة على ذلك، ويتضح ذلك كيف يمكن لهذا النهج علم البصريات الوراثي المجراة سابقا يمكن تطبيقها لتقييم أنماط الاتصال رواية باستخدام مجموعة من الخلايا العصبية GABAergic في اللوزة، وparacapsular مجموعة مقحم الخلية (mpITC)، على سبيل المثال.
Introduction
أدوات دقيقة لتصور وتفعيل المتزامن لاتصالات محددة بين مناطق الدماغ وأنواع معينة من الخلايا العصبية أصبحت أكثر أهمية في فهم الكامنة صحية وظيفة الدماغ ومرض دول الربط الوظيفي. من الناحية المثالية، وهذا يستلزم التحقيق الفسيولوجية من خصائص متشابك دقيقة مع الذي حدد الخلايا العصبية التواصل. هذا صحيح بصفة خاصة للاتصالات بين مناطق الدماغ التي لا يمكن الحفاظ عليها في شريحة الدماغ الحادة واحدة هذا. في الماضي، وقد تحقق هذا إلى حد كبير في تجارب منفصلة. من ناحية، ضخت استشفاف العصبية في الجسم الحي واستخدمت جنبا إلى جنب مع ضوء لاحقة أو الإلكترون المجهري تحليل الشركاء قبل وبعد المشبكي. من ناحية أخرى، عندما يتم الحفاظ على مساحات الألياف من منطقة المنشأ ويمكن الوصول إليها في إعداد شريحة، وقد استخدم التحفيز الكهربائي لتقييم آليات الاتصال متشابك مع الخلايا في المنطقة المستهدفة.
مع ظهور علم البصريات الوراثي، والتعبير المستهدفة من قنوات الموجبة للضوء بوابات، مثل Channelrhodopsins (س.) لتنصهر البروتينات الفلورية، يمكن الآن تنشيط الخلايا العصبية ومساراتها محور عصبي بينما يسمح لتصور وبعد تحليل خاص التشريحية 1- 4. لأن المحاور مركز حقوق الانسان، معربا عن أن يكون حافزا حتى عندما قطعت من somata الأم 5، فمن الممكن في شرائح الدماغ إلى: 1) تقييم المدخلات من مناطق الدماغ التي لم تكن في متناول مع التحفيز الكهربائي التقليدية، لأن مساحات الألياف لا يمكن فصلها أو مسار معين ليس معروفا؛ 2) تحديد بشكل لا لبس فيه المنطقة من أصل لالمدخلات المحددة التي تم المفترضة ولكن غير مفهومة تماما. و3) تحقيق الربط الوظيفي بين أنواع الخلايا المحددة، على حد سواء محليا والتوقعات بعيدة المدى. بسبب وجود عدد من المزايا، أصبح هذا التعيين علم البصريات الوراثي للدوائر في شرائح الدماغ واسعةلاي المستخدمة في السنوات الأخيرة، ومجموعة متنوعة من النواقل الفيروسية للتعبير عن س. fluorescently الموسومة متوفرة بسهولة من الموردين التجارية. بعض المزايا الرئيسية لتفعيل علم البصريات الوراثي على التحفيز الكهربائي التقليدية هي عدم وجود ضرر في الأنسجة نتيجة لوضع أقطاب كهربائية التحفيز، خصوصية تحفيز ألياف بسبب التحفيز الكهربائي ويمكن أيضا توظيف الألياف المرور أو خلايا أخرى مجاورة، والتحفيز السريع على قدم المساواة ودقيق زمنيا. وبالإضافة إلى ذلك، حقن المجسم من ناقلات فيروسية يمكن بسهولة أن تستهدف مناطق محددة في الدماغ 6 و المشروط أو خلية من نوع التعبير محددة يمكن تحقيق ذلك باستخدام التعبير لجنة المساواة العرقية التي تعتمد و / أو المروجين محدد 7. هنا، يتم تطبيق هذه التقنية لرسم خرائط طويلة المدى ودوائر المحلية في نظام الخوف.
اللوزة هي منطقة رئيسية لاكتساب والتعبير عن الخوف، وتخزين الخوف والذكريات العاطفية 8،9. وبصرف النظر جيئة وذهابام اللوزة، وقشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) وقرن آمون (HC)، والهياكل التي ترتبط تبادليا اللوزة، وتورط في جوانب الاستحواذ، وتوطيد واسترجاع الخوف والانقراض ذكريات 10،11. يبدو النشاط في التقسيمات الفرعية للmPFC أن تلعب دورا مزدوجا في السيطرة على الخوف على حد سواء ارتفاع وانخفاض تنص 12،13. يمكن أن يكون في اطار بوساطة ذلك عن طريق الاتصالات المباشرة من mPFC إلى اللوزة المخية التي من شأنها أن تتحكم في نشاط اللوزة والإخراج. لذلك، في السنوات الأخيرة، بدأت عدة دراسات في السابق تجارب شريحة الجسم الحي للتحقيق في التفاعلات متشابك بين afferents mPFC والخلايا المستهدفة المحددة في اللوزة 14-17.
خلال التعلم الخوف والمعلومات الحسية عن المحفزات مكيفة وغير مشروطة تصل اللوزة عبر التوقعات من المناطق المهادية والقشرية محددة. اللدونة من هذه المدخلات إلى الخلايا العصبية في الجزء الجانبي (LA) من basolاللوزة ateral (جيش تحرير بلوشستان) هي آلية هامة الكامنة تكييف الخوف 9،18. وتشير أدلة متزايدة على أن عمليات البلاستيك موازية في اللوزة تنطوي على عوامل المثبطة للسيطرة على ذاكرة الخوف 19. مجموعة من الخلايا العصبية المثبطة مقسمة إلى كتل هي GABAergic سطي paracapsular مقحم الخلايا (mpITCs)، ولكن التواصل فيما بينها الدقيق وظيفة غير مفهومة تماما 20-22. هنا، يتم استخدام خرائط الدوائر علم البصريات الوراثي لتقييم وارد وصادر التواصل بين هذه الخلايا وتأثيرها على الخلايا العصبية المستهدفة في اللوزة المخية، مما يدل على أن mpITCs تلقي المدخلات الحسية المباشرة من محطات التقوية المهادية والقشرية 23. تعبيرا محددا من مركز حقوق الانسان في mpITCs أو الخلايا العصبية جيش تحرير بلوشستان يسمح رسم الخرائط من التفاعلات المحلية، وكشف عن أن mpITCs تمنع، ولكن أيضا تنشيط للطرفين من خلال الخلايا العصبية الرئيسية جيش تحرير بلوشستان، وتجعلهم في الدوائر المثبطة رواية التغذية إلى الأمام وردود الفعل التي تتحكم في فعالية النشاط جيش تحرير بلوشستان23.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لخارج الحي التحقيق علم البصريات الوراثي من الدوائر العصبية والربط المحلية التي يمكن تنفيذها بسهولة على معظم، إن لم يكن كلها، تستقيم شريحة تسجيل التصحيح، المشبك الاجهزة عن طريق تزويدهم مع ~ 470 نانومتر LED في ميناء ضوء epifluorescence. والميزة الر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Materials
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
References
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
- Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
- Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).
- Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).
- Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).
- Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).
- Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).
- Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).
- Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
- Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).
- Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).
- Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).
- Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).
- Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
- Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).
- Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).
- Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).
- Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).
- Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
- Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).
- Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
- McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).
- Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
