Summary

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Published: April 05, 2016
doi:

Summary

Optogenetische benaderingen worden wijd gebruikt om neurale activiteit te manipuleren en de gevolgen voor hersenfunctie beoordelen. Hier, wordt een techniek beschreven die bij in vivo expressie van het optische activator Channelrhodopsin, maakt de ex vivo analyse van synaptische eigenschappen specifieke lange afstand en lokale neurale verbindingen in angst gerelateerde circuits.

Abstract

Optogenetische benaderingen worden nu op grote schaal gebruikt om de functie van neurale populaties en circuits te bestuderen door het combineren van gerichte expressie van licht geactiveerd eiwitten en daaropvolgende manipulatie van neurale activiteit door licht. Channelrhodopsins (CHR) zijn licht-gated kation-kanalen en wanneer gefuseerd aan een fluorescerend eiwit hun expressie maakt visualisatie en gelijktijdige activering van specifieke celtypen en hun axonale uitsteeksels in bepaalde hersengebieden. Via stereotactische injectie van virale vectoren, kunnen chr fusie-eiwitten constitutief of voorwaardelijk worden uitgedrukt in specifieke cellen van een bepaald hersengebied, en hun axonale projecties kan vervolgens anatomisch en functioneel worden bestudeerd via ex vivo optogenetic activatie in de hersenen plakjes. Dit is van bijzonder belang wanneer gericht op synaptische eigenschappen van verbindingen die niet met gebruikelijke elektrische stimulatie benaderingen kunnen worden aangepakt begrijpen of kunnen nieuwe affehuurprijs en efferente connectiviteit die eerder was slecht begrepen. Hier enkele voorbeelden hoe deze techniek kan worden toegepast op deze vragen ophelderen angst-gerelateerde circuits in de amygdala onderzoeken. De amygdala is een belangrijke regio voor het verwerven en expressie van angst, en de opslag van angst en emotionele herinneringen. Vele lijnen van bewijs suggereren dat de mediale prefrontale cortex (mPFC) neemt deel aan verschillende aspecten van angst acquisitie en extinctie, maar de precieze connectiviteit met de amygdala is net begonnen te begrijpen. Ten eerste wordt getoond hoe ex vivo optogenetic activering kan worden gebruikt om aspecten van synaptische communicatie tussen mPFC afferenten en target cellen te bestuderen in de basolaterale amygdala (BLA). Verder wordt geïllustreerd hoe dit ex vivo optogenetic benadering kan worden toegepast op nieuwe connectiviteitspatronen behulp van een groep van GABAerge neuronen in de amygdala beoordelen, de paracapsular geïntercaleerde celcluster (mpITC) als voorbeeld.

Introduction

Nauwkeurige instrumenten voor visualisatie en gelijktijdige activering van specifieke verbindingen tussen hersengebieden en specifieke typen neuronen worden steeds belangrijker in het begrijpen van de functionele connectiviteit onderliggende gezonde hersenfunctie en ziektebeelden. Idealiter dit met zich meebrengt fysiologisch onderzoek naar nauwkeurige synaptische eigenschappen waarmee geïdentificeerde neuronen communiceren. Dit geldt met name voor verbindingen tussen hersengebieden die in één enkele plak acute hersenen kan worden behouden. In het verleden is dit grotendeels bereikt in afzonderlijke experimenten. Enerzijds, neurale tracers geïnjecteerd in vivo zijn gebruikt in combinatie met daaropvolgende licht- of elektronenmicroscopische analyse van pre- en postsynaptische partners. Anderzijds, wanneer zenuwbanen van het gebied van herkomst bewaard en toegankelijk in de slice voorbereiding, elektrische stimulatie is gebruikt om synaptische communicatiemechanismen ervan met cellen in het doelgebied.

Met de komst van optogenetics, de gerichte expressie van licht-gated kation-kanalen, zoals Channelrhodopsins (CHR) gefuseerd aan fluorescerende eiwitten, zodat nu activatie van neuronen en hun axonale trajecten terwijl voor de visualisatie en post-hoc analyse anatomische 1- 4. Omdat CHR-expressie axonen ook kan worden gestimuleerd wanneer gescheiden van ouder somata 5, kan in de hersenen plakjes: 1) beoordelen input van hersengebieden die niet toegankelijk zijn met gebruikelijke elektrische stimulatie genoemd, omdat zenuwbanen niet splitsbaar of specifieke traject is niet bekend; 2) ondubbelzinnig de regio van herkomst voor specifieke inputs die werden vooropgesteld, maar onvolledig begrepen te identificeren; en 3) het onderzoeken van de functionele connectiviteit tussen gedefinieerde celtypes, zowel lokaal als in de lange-afstands projecties. Door een aantal voordelen, heeft deze optogenetic mapping circuits in hersenplakken breed gewordenly gebruikt in de afgelopen jaren, en verschillende virale vectoren voor expressie van fluorescent-gelabeld CHRS zijn verkrijgbaar bij commerciële leveranciers. Enkele belangrijke voordelen van optogenetic activering via conventionele elektrische stimulatie geen schade aan het weefsel door de plaatsing van de stimulatie-elektroden, specificiteit vezels stimulatie omdat elektrische stimulatie ook vezels van doorgang of andere nabijgelegen cellen, en een even snelle en temporeel precieze stimulatie werven. Bovendien kan stereotactische injectie van virale vectoren gemakkelijk worden gericht op specifieke hersengebieden 6 en voorwaardelijke of celtype specifieke expressie kan worden verkregen door Cre-afhankelijke expressie en / of specifieke promoters 7. Hier, wordt deze techniek toegepast voor het in kaart brengen van de lange afstand en de plaatselijke omlopen in de vreze systeem.

De amygdala is een belangrijke regio voor het verwerven en expressie van angst, en de opslag van angst en emotionele herinneringen 8,9. Apart weerm de amygdala, de mediale prefrontale cortex (mPFC) en hippocampus (HC), structuren die onderling zijn verbonden met de amygdala, zijn betrokken bij aspecten van acquisitie, consolidatie en ophalen van angst en extinctie geheugens 10,11. Activiteit in de deelsectoren van de mPFC lijkt een dubbele rol te spelen bij de bestrijding van zowel hoge als lage angst verklaart 12,13. Dit kan voor een deel worden veroorzaakt door rechtstreekse verbindingen vanuit mPFC naar de amygdala dat de amygdala-activiteit en de output zou controleren. Daarom is in de afgelopen jaren hebben verschillende studies begonnen in ex vivo experimenten slice synaptische interacties tussen mPFC afferenten en specifieke doelcellen te onderzoeken in de amygdala 14-17.

Tijdens angst leren, sensorische informatie over airconditioning en ongeconditioneerde stimuli bereikt de amygdala via projecties van specifieke thalamische en corticale gebieden. Plasticiteit van deze ingangen neuronen in het laterale deel (la) van de Basolateral amygdala (BLA) is een belangrijk mechanisme dat ten grondslag vreesconditionering 9,18. Steeds meer bewijs suggereert dat parallelle plastic processen in de amygdala te betrekken remmende elementen om angst geheugen 19 te controleren. Een groep van geclusterde remmende neuronen zijn de GABAergic mediale paracapsular ingelast cellen (mpITCs), maar hun precieze verbinding en de functie is onvolledig begrepen 20-22. Hier wordt optogenetic circuit mapping gebruikt om afferente en efferente connectiviteit van deze cellen en hun impact op de doelgroep neuronen in de amygdala te beoordelen, waaruit blijkt dat mpITCs ontvangen directe zintuiglijke input van thalamus en corticale relay stations 23. Specifieke expressie van CHR in mpITCs of BLA neuronen maakt het in kaart brengen van de lokale interacties, waaruit blijkt dat mpITCs remmen, maar ook onderling geactiveerd door, BLA opdrachtgever neuronen, ze te plaatsen in de roman van feed-forward en feedback remmende circuits die effectief BLA activiteit te controleren23.

Protocol

Ethiek statement: Alle experimentele procedures waren in overeenstemming met de EU-richtlijn over het gebruik van dieren in onderzoek en werden goedgekeurd door de lokale Animal Care en gebruik Comite (Regierungspräsidium Tübingen, deelstaat Baden-Württemberg, Duitsland), die verantwoordelijk is voor de Universiteit van Tübingen. 1. stereotactische injectie Procedure Bereid steriele instrumenten (schaar, scalpel, klemmen, boren, naalden, hechtmateriaal) met behulp van een sterilisator. Regelen ste…

Representative Results

In dit gedeelte wordt de workflow van een ex vivo optogenetic aanpak en representatieve resultaten van verschillende experimentele strategieën om de fysiologische eigenschappen van sensorische en modulerende lange afstand projecties BLA en mpITC neuronen evenals eigenschappen van de lokale verbinding tussen mpITC en BLA onderzoeken. Na stereotactische injectie van de geselecteerde virale vector op de gewenste coördi…

Discussion

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor ex vivo optogenetic onderzoek van neurale circuits en lokale verbindingen die gemakkelijk kunnen worden toegepast op de meeste, zo niet alle, rechte segment patch-clamp setups door hen uit te rusten met een ~ 470 nm LED op epifluorescentie lichtpoort. Een groot voordeel van optogenetic stimulatie van axonale uitsteeksels in plakjes is dat het specifieke activatie en onderzoeken van eigenschappen van verbindingen die niet toegankelijk zijn met gebruikelijke elektrische …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.

Materials

Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006–50—-ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585
                     (emission) AHF, Germany F47-630
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W
                         (emission) AHF, Germany F76-490
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406–25——N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

References

  1. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
  4. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  5. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
  6. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  7. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  8. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  9. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
  10. Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).
  11. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).
  12. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).
  13. Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).
  14. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).
  15. Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).
  16. Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
  17. Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).
  18. Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).
  19. Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).
  20. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).
  21. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).
  22. Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
  23. Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).
  24. Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).
  25. Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
  26. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).
  27. Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).
  28. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  29. Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).
  30. Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).
  31. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
  32. Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).
  33. Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
  34. Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).
  35. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).
  36. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), (2013).
  37. Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).
  38. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
  39. McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).
  40. Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).

Play Video

Cite This Article
Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

View Video