Summary

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Published: April 05, 2016
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Summary

Optogenetische Ansätze sind weit verbreitet zu manipulieren neuronale Aktivität und bewerten die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion verwendet. Hier wird eine Technik erläutert , dass bei invivo – Expression des optischen Aktivator Channelrhodopsin, ermöglicht eine ex vivo Analyse der synaptischen Eigenschaften bestimmter großer Reichweite und lokale neuronale Verbindungen in Angst bezogenen Schaltungen.

Abstract

Optogenetische Ansätze sind heute weit verbreitet durch die Kombination gezielte Expression von lichtaktivierten Proteine ​​und die anschließende Manipulation der neuronalen Aktivität die Funktion neuronaler Populationen und Schaltungen, die durch Licht zu studieren verwendet. Channelrhodopsinen (CHRS) sind lichtgesteuerter Kationenkanäle, und wenn ihre Expression ermöglicht die Visualisierung und gleichzeitige Aktivierung spezifischer Zelltypen und deren axonale Projektionen in definierten Bereichen des Gehirns zu einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Via stereotaktische Injektion von viralen Vektoren, ChR Fusionsproteine ​​konstitutiv werden können oder bedingt in spezifischen Zellen eines bestimmten Gehirnregion zum Ausdruck gebracht, und ihre axonalen Projektionen können anschließend anatomisch und funktionell mit Hilfe von Exvivo – optogenetische Aktivierung in Hirnschnitten untersucht werden. Dies ist von besonderer Bedeutung während des Zielens synaptischen Eigenschaften der Verbindungen zu verstehen, die nicht mit herkömmlichen elektrischen Stimulations Ansätzen angegangen werden können, oder bei der Identifizierung von neuen AffeMiete und ableitende Konnektivität, die bisher kaum verstanden wurde. Hier einige Beispiele veranschaulichen, wie diese Technik angewendet werden kann, um diese Fragen zu Aufklären Angst bezogenen Schaltungen in der Amygdala zu untersuchen. Die Amygdala ist eine Schlüsselregion für den Erwerb und die Expression von Angst und Speicherung von Angst und emotionale Erinnerungen. Viele Beweislinien legen nahe, dass die medialen präfrontalen Kortex (mPFC) in verschiedenen Aspekten der Angst Erfassung beteiligt und Extinktion, aber seine genaue Konnektivität mit der Amygdala beginnt gerade zu verstehen. Zuerst wird gezeigt , wie ex vivo optogenetische Aktivierung verwendet werden können Aspekte der synaptischen Verbindung zwischen mPFC Afferenzen und Zielzellen in der basolateralen Amygdala (BLA) zu studieren. Ferner ist dargestellt , wie diese ex vivo optogenetische Vorgehensweise angewendet werden kann , um neue Konnektivitätsmuster unter Verwendung einer Gruppe von GABA – ergen Neuronen in der Amygdala, dem paracapsular interkalierten Zellcluster (mpITC) als Beispiel zu bewerten.

Introduction

Präzise Werkzeuge zur Visualisierung und gleichzeitige Aktivierung von spezifischen Verbindungen zwischen den Gehirnbereichen und bestimmten Arten von Neuronen werden immer wichtiger, um die funktionelle Konnektivität zugrunde liegende gesunde Gehirnfunktion und Krankheitszuständen zu verstehen. Idealerweise führt diese physiologische Untersuchung der genauen synaptischen Eigenschaften, mit denen identifiziert Neuronen kommunizieren. Dies gilt insbesondere für Verbindungen zwischen Gehirnbereichen, die nicht in einer einzigen akuten Hirnschnitt erhalten werden kann. In der Vergangenheit wurde dies in getrennten Experimenten weitgehend erreicht. Zum einen injizierten neuronalen Tracern in vivo wurden mit anschließender licht- oder elektronenmikroskopische Analyse der prä- und postsynaptischen Partnern kombiniert eingesetzt. Auf der anderen Seite, wenn Faserbahnen aus der Herkunftsregion erhalten sind und zugänglich im Schnittpräparat wurde eine elektrische Stimulation verwendet synaptischen Kommunikationsmechanismen mit Zellen in der Zielregion zu beurteilen.

Mit dem Aufkommen von Optogenetik, die gezielte Expression von lichtgesteuerten Kationenkanäle wie Channelrhodopsine (CHRS) an fluoreszierenden Proteinen fusioniert, ermöglicht nun die Aktivierung von Neuronen und ihrer axonalen Trajektorien während es für ihre Visualisierung und post-hoc – Analyse anatomischer 1- 4. Weil chr-exprimierenden Axone sogar stimuliert werden kann , wenn von den Eltern somata 5 durchtrennt, ist es möglich , in brain slices: 1) Eingänge von Hirnregionen beurteilen , die nicht zugänglich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation waren, weil Faserbahnen nicht trennbar oder der spezifische Trajektorie ist nicht bekannt; 2) eindeutig die Herkunftsregion für bestimmte Eingaben zu identifizieren, die postuliert, wurden aber nicht vollständig verstanden; und 3) untersuchen die funktionelle Konnektivität zwischen definierten Zelltypen, sowohl lokal als auch in langfristigen Projektionen. Wegen einer Reihe von Vorteilen, diese optogenetische Abbildung von Schaltkreisen in Hirnschnitten geworden breitenly verwendet in den letzten Jahren, und eine Vielzahl von viralen Vektoren für die Expression von fluoreszenzmarkierten CHRS von kommerziellen Anbietern leicht erhältlich. Einige der wichtigsten Vorteile von optogenetische Aktivierung über herkömmliche elektrische Stimulation sind keine Schädigung des Gewebes durch die Platzierung der Stimulationselektroden, eine Spezifität von Faser Stimulation, weil die elektrische Stimulation auch Fasern der Passage oder anderen nahe gelegenen Zellen rekrutieren können, und eine ebenso schnelle und zeitlich präzise Stimulation. Zusätzlich können stereotaktische Injektion von viralen Vektoren können leicht an spezifischen Gehirnbereichen 6 und bedingte oder zelltypspezifische Expression 7 unter Verwendung von Cre-abhängige Expression und / oder spezifischer Promotoren erreicht werden , ausgerichtet sein. Hier wird diese Technik zur Kartierung von Langstrecken und lokale Schaltungen in der Angst-System angewendet.

Die Amygdala ist eine Schlüsselregion für den Erwerb und die Expression von Angst und Speicherung von Angst und emotionale Erinnerungen 8,9. Neben from die Amygdala, dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) und Hippocampus (HC), Strukturen, die auf der Amygdala reziprok verbunden sind, werden in Aspekten der Erfassung, Konsolidierung und den Abruf von Angst und Extinktion Erinnerungen 10,11 gebracht. Aktivität in Unterteilungen des mPFC erscheint bei der Kontrolle der hohen und niedrigen Angst heißt 12,13 eine doppelte Rolle zu spielen. Dies könnte teilweise durch direkte Verbindungen von mPFC zur Amygdala vermittelt werden, die Amygdala-Aktivität steuern würde und ausgegeben. Daher ist in den letzten Jahren begannen mehrere Studien in ex vivo Scheibe Experimente synaptische Interaktionen zwischen mPFC Afferenzen und spezifischen Zielzellen in der Amygdala 14-17 zu untersuchen.

Während Angst Lernen erreicht sensorische Informationen über bedingten und unbedingten Stimuli die Amygdala über Projektionen von spezifischen Thalamus und kortikale Regionen. Plasticity dieser Eingänge der Neuronen in dem Seitenteil (LA) des Basolateral Amygdala (BLA) ist ein wichtiger Mechanismus Angstkonditionierung 9,18 zugrunde liegen. Zunehmende Hinweise darauf , dass parallel Kunststoff Prozesse in der Amygdala hemmenden Elemente beinhalten Angst Speicher zur Steuerung 19. Eine Gruppe von Cluster – inhibitorischen Neuronen sind die GABA – erge medialen paracapsular interkaliert Zellen (mpITCs), aber ihre genaue Konnektivität und Funktion versteht sich unvollständig 20-22. Hier wird optogenetische Schaltung Mapping verwendet und abführenden Konnektivität dieser Zellen und deren Auswirkungen auf die Zielneuronen in der Amygdala beurteilen zu können , was zeigt , dass mpITCs direkten sensorischen Input von Thalamus und kortikale Relaisstationen 23 empfangen. Spezifische Expression von ChR in mpITCs oder BLA Neuronen ermöglicht die Zuordnung von lokalen Interaktionen und enthüllt, dass mpITCs hemmen, sind aber auch für beide Seiten aktiviert durch, BLA Haupt Neuronen, so dass sie in neuartigen Feedforward und Feedback hemmende Schaltungen platzieren, die effektiv BLA Aktivität steuern23.

Protocol

Ethik Aussage: Alle experimentellen Verfahren waren in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie über die Verwendung von Tieren in der Forschung und wurden von der lokalen Animal Care und Use Committee (Regierungspräsidium Tübingen, Baden-Württemberg, Deutschland), die für die Universität Tübingen genehmigt. 1. Stereotactic Injektionsverfahren Bereiten Sie sterile Werkzeuge (Schere, Skalpell, Klemmen, Bohrer, Nadeln, Nahtmaterial) mit einem Sterilisator. Anordnen sterile Instrumente und andere erf…

Representative Results

Dieser Abschnitt zeigt den Workflow eines ex vivo optogenetischen Ansatz und repräsentative Ergebnisse aus verschiedenen experimentellen Strategien , um die physiologischen Eigenschaften von sensorischen und modulierende Langstrecken – Projektionen BLA und mpITC Neuronen sowie Eigenschaften der lokalen Konnektivität zwischen mpITC und BLA zu untersuchen. Nach stereotaktische Injektion des ausgewählten Virusvektor a…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur ex vivo optogenetische Untersuchung von neuronalen Schaltkreise und lokale Konnektivität , die leicht auf die meisten umgesetzt werden können, wenn alle aufrechten Scheibe Patch-Clamp – Aufnahme – Setups , indem sie mit einem ~ 470 nm LED an der Epifluoreszenz Licht Port Ausrüstung nicht. Ein großer Vorteil der optogenetische Stimulation der axonale Projektionen in Scheiben ist, dass es für die spezifische Aktivierung und Untersuchung von Eigenschaften von Verb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.

Materials

Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006–50—-ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585
                     (emission) AHF, Germany F47-630
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W
                         (emission) AHF, Germany F76-490
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406–25——N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

References

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Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

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