عزل CD146<sup> +</sup> خلايا المقيم الرئة الجذعية الوسيطة اللحمية من الجرذ الرئتين
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية العزل للحصول على خلايا اللحمة المتوسطة انسجة الرئة المقيمين الأولية من الفئران، من خلال استخدام الهضم الأنزيمي، كثافة الفصل المتدرج، والتقيد البلاستيك وCD146 + اختيار حبة المغناطيسي.
Abstract
يتم التعرف على الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) على نحو متزايد لإمكاناتها العلاجية في مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك أمراض الرئة. إلى جانب استخدام نخاع العظام واللجان الدائمة الحبل السري لعلاج الخلايا خارجي، وهناك أيضا زيادة الاهتمام في إصلاح وإمكانات التجدد من اللجان الدائمة الأنسجة المقيمين. وعلاوة على ذلك، فإنها من المحتمل أن يكون لها دور في تطوير الجهاز العادي، ونسبت الأدوار في المرض، وخاصة تلك التي لها طبيعة متليفة. العقبة الرئيسية لدراسة هذه اللجان الدائمة الأنسجة المقيمة هو عدم وجود علامة واضحة لعزل والتعرف على هذه الخلايا. تقنية العزل الموصوفة هنا تنطبق خصائص متعددة من اللجان الدائمة المقيمين الرئة (L-اللجان الدائمة). على التضحية من الفئران، تتم إزالة الرئتين وتشطف عدة مرات لإزالة الدم. وبعد تفكك الميكانيكي بواسطة مشرط، يتم هضمها الرئتين لمدة 2-3 ساعة باستخدام مزيج من نوع كولاجيناز الأول، البروتيني محايد ونوع الدناز أولا obtaineيتم غسل د تعليق خلية واحدة في وقت لاحق، ومركبة على كثافة متوسطة الانحدار (الكثافة 1.073 غ / مل). بعد الطرد المركزي، ويتم غسل الخلايا من الطور البيني ومطلي في قوارير المعالجة الثقافة. الخلايا المستنبتة ل4-7 أيام في الفسيولوجي 5٪ O 2 و 5٪ CO 2 الشروط. في استنزاف الخلايا الليفية (CD146 -) وضمان عدد سكانها فقط L-اللجان الدائمة (CD146 +)، واختيار إيجابية للCD146 + الخلايا تتم من خلال اختيار حبة المغناطيسي. باختصار، هذا الإجراء ينتج موثوق يبلغ عدد سكانها الأساسي L-اللجان الدائمة لمزيد من الدراسة والتلاعب في المختبر. ونظرا للطبيعة البروتوكول، فإنه يمكن بسهولة أن تترجم إلى النماذج الحيوانية التجريبية الأخرى.
Introduction
يتم التعرف على الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) على نحو متزايد لإمكاناتها العلاجية في مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك أمراض الرئة. إلى جانب استخدام نخاع العظام واللجان الدائمة الحبل السري لعلاج الخلايا خارجي، وهناك أيضا زيادة الاهتمام في إصلاح وإمكانات التجدد من اللجان الدائمة الأنسجة المقيمين. خلال التنمية، بما في ذلك الرئة، واللحمة المتوسطة تعد مصدرا مهما من العظة التنموية، واللجان الدائمة المقيمين هي المرشح المرجح أن يكون في مركز هذا. وعلاوة على ذلك، تظهر دلائل على ومضطرب أن اللجان الدائمة المقيمين في أمراض البالغين، بما في ذلك السرطان وتليف 1،2 3. العقبة الرئيسية لدراسة هذه اللجان الدائمة الأنسجة المقيمة هو عدم وجود علامة واضحة لعزل والتعرف على هذه الخلايا 4. الخلايا الجذعية مستضد 1 تم تحديد (SCA-1) في الفئران كعلامة لمجموعة متنوعة من الخلايا الجذعية الأنسجة، ويمكن استخدامها لعزل L-اللجان الدائمة 5، ولكن للاسفلا يعرف orthologs في الأنواع الأخرى 6. وأفاد الباحثون مجموعة متنوعة من أساليب العزلة مختلفة لعزل L-اللجان الدائمة سواء من أنسجة الرئة أو السوائل. هذه تختلف من مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) على أساس أساليب اختيار لCD31 – / CD45 – / CD90 + الخلايا 7، CD31 – / CD45 – / الظهارية خلية التصاق جزيء (EpCAM) – / هيئة السلع التموينية-1 + خلايا 8، المقاومة للأدوية المتعددة نقل ATP كاسيت ملزمة G (ABCG2) خلايا إيجابية 9 أو هويشت 33342 صبغ هروب رأس المال 10، إلى التقيد البلاستيك 11،12 والهجرة من مفروم النسيج 13.
مزايا الطريقة هنا المعروضة لعدة أضعاف. باستخدام الهضم الأنزيمي لطيف والتدرج الكثافة 14، واحد يحصل على جميع خلايا نطاق الكثافة التي تشمل اللجان الدائمة ولكنها تستبعد الخلايا الظهارية أو البطانية. الخطوة التزام البلاستيكية اللاحقة يضمن فقط mesenchخلايا ymal التمسك والبقاء في الثقافة، والقضاء على الكريات البيض. الأهم من ذلك، في خطوة اختيار CD146 + يسمح للقضاء على الخلايا الليفية، وهذه الخلايا لا تعبر عن CD146. يرتبط ارتباطا وتعبيرا عن التصاق الخلية الجزيء CD146 بإيجابية مع multipotency، وبالتالي فهي علامة جيدة للتخلص من الخلايا الليفية من سكان الخلية الوسيطة 15-19. هذا هو ميزة على استخدام CD90 كعلامة الاختيار، كما لا يعبر عنه إلا في اللجان الدائمة ولكن أيضا في lipofibroblasts 5،20. في هذا البروتوكول الذي اخترناه صراحة مجموعة مختارة حبة المغناطيسي، كما هو ألطف على الخلايا، والإجراء بأكمله يمكن أن يتم في ظروف معقمة. ميزة هامة أخرى من هذا الأسلوب العزلة بدلا من طريقة ثمرة، هو أنه سريع نسبيا، 6-10 أيام بدلا من شهر واحد أو أكثر للأسلوب ثمرة. بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من العزلة الأولية السكان الوسيطة جاهز للCD146 + سيلي ction. بعد 3-5 أيام آخر الخلايا CD146 + جاهزة لاستخدامها في التجارب أو يمكن تجميدها لاستخدامها لاحقا. الوقت انخفضت الثقافة يحسن نوعية الخلايا كما تحورها اللجان الدائمة نحو الخلايا الليفية لفترات طويلة خارج الحي الثقافة 19. وأخيرا، ونظرا للطبيعة البروتوكول، فمن الممكن تطبيق هذه الطريقة مع الأنواع الأخرى ببساطة عن طريق اختيار الأجسام المضادة المناسبة، أو حتى إلى أجهزة الجسم الأخرى عن طريق ضبط خيارات إنزيمات الهضم وفترة حضانة.
يعطى بروتوكول مفصل لهذا الأسلوب العزلة أدناه، وتقدم عرضا عاما من العزلة واختيار لاحقة من حيوانية CD146 + في الشكل 1A 1B وعلى التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تضمنت تفاصيل عن الركض، وتجميد والذوبان هذه الخلايا.
إعلان / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي لعزل الخلايا الرئوية الوسيطة (A) وCD146 لاحق + اختيار الخلية (ب) دقيقة = دقيقة؛ EDTA = ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل. 2 الثانية أب = الأجسام المضادة الثانوية؛ ألفا CD146 أب = الأساسي الأجسام المضادة لمكافحة CD146. خلايا، لقد = CD146 الخلايا السلبية. + لقد خلايا إيجابية الخلايا = CD146. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم العزلة وثقافة الأساسي L-اللجان الدائمة فرصة لفهم أفضل وظيفة وتفاعلها مع السكان خلية أخرى على المستوى الخلوي، ودورها في التنمية الرئة، والصحة والمرض. وهذا أمر مهم خاصة أن عدم وجود علامة واحدة معينة من هذه الخلايا تجعل من شبه المستحيل لدراسة هذه الخلايا في المو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation – Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children’s Hospital of Eastern Ontario Research Institute.
Materials
| Neutral Protease | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| Collagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| Pentobarbital sodium (Euthanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland | – | Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more. |
| Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose | Life Technologies | 14287-072 | Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC. |
| αMEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Warm in 37oC water bath before use |
| 200 mM L-Glutamine | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | Penicillin/Streptomycin/Fungizone |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Magnetic beads |
| biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below |
| DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE |
| anti-rat CD146 antibody | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12.5 μl per 0.5 x 106 cells |
| Pentaspan (pentastarch solution) | Bristol-Myers Squibb Canada | – | Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl. |
| Mr.Frosty freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC |
References
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
- Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
- Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
- McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
- Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer–different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
- Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , (2011).
- Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
- Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
- Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
- Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
- Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
- Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
- Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
- Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
- Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
- Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
- Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
- McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
- Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
- Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498 (2009).
- Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
- Respiratory Physiology. UCL Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015)
- Boron, W. F., Boulpaep, E. L. . Medical Physiology. 2nd edn. , (2009).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
- Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
- Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
- Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
- Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
- Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
- Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
- Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
- Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
- Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
- da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
- McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
- Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
- Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
- Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
- Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).
