Isolement de CD146⁺ Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons

Summary

Ce protocole décrit une technique d'isolation pour obtenir des cellules mésenchymateuses du stroma de séjour du poumon primaires de rats, par l'utilisation d'une digestion enzymatique, séparation par gradient de densité, l'adhérence plastique et CD146 ⁺ sélection de billes magnétiques.

Abstract

cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont de plus en plus reconnus pour leur potentiel thérapeutique dans un large éventail de maladies, y compris les maladies pulmonaires. Outre l'utilisation de l'os MSC de cordon ombilical pour la thérapie cellulaire exogène osseuse et, il est également un intérêt croissant pour la réparation et le potentiel de régénération des cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents. En outre, ils ont probablement un rôle dans le développement normal des organes, et elles ont été attribué un rôle dans les maladies, en particulier ceux qui ont une nature fibreuse. Le principal obstacle pour l'étude de ces cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents est l'absence d'un marqueur clair pour l'isolement et l'identification de ces cellules. La technique d'isolement décrites ici applique plusieurs caractéristiques de cellules souches mésenchymateuses de résidents du poumon (L-MSC). Sur le sacrifice des rats, les poumons sont retirés et rincés plusieurs fois pour enlever le sang. Suite à la dissociation mécanique de scalpel, les poumons sont digérés pendant 2 à 3 heures en utilisant un mélange de collagénase de type I, de type protéase neutre et de la DNase I. Le obtained suspension cellulaire unique est ensuite lavée et posés sur milieu à gradient de densité (densité 1,073 g / ml). Après centrifugation, les cellules de l'interphase sont lavées et étalées dans des flacons de culture traitée. Les cellules sont cultivées pendant 4-7 jours dans physiologique 5% O _2, 5% CO ₂ conditions. Pour épuiser fibroblastes (CD146 ^-) et d'assurer une population de seulement L-MSC (CD146 ^+), la sélection positive pour CD146 ^{+ cellules} est effectuée par la sélection des billes magnétiques. En résumé, cette procédure produit fiable une population de primaire L-MSC pour complément d'étude in vitro et la manipulation. En raison de la nature du protocole, il peut facilement être converti en d'autres modèles animaux expérimentaux.

Introduction

cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont de plus en plus reconnus pour leur potentiel thérapeutique dans un large éventail de maladies, y compris les maladies pulmonaires. Outre l'utilisation de l'os MSC de cordon ombilical pour la thérapie cellulaire exogène osseuse et, il est également un intérêt croissant pour la réparation et le potentiel de régénération des cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents. Au cours du développement, y compris dans le poumon, le mésenchyme est une source importante d'indices de développement, et MSC résidents sont un candidat susceptible d'être au centre de cette. De plus, la preuve est en train d'émerger que les CSM résidents sont perturbés dans les maladies adultes, y compris le cancer et la fibrose ^{1,2 3.} Le principal obstacle pour l'étude de ces cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents est l'absence d'un marqueur clair pour l'isolement et l'identification de ces cellules ^4. Cellules souches antigène-1 (Sca-1) a été identifié chez la souris en tant que marqueur pour une variété de cellules souches de tissu, et peut être utilisée pour l'isolement de cellules souches mésenchymateuses ^L-5, mais il a malheureusementpas connu orthologues chez d'autres espèces ^6. Les chercheurs ont fait état d'une variété de différentes méthodes d'isolement pour l'isolement de la L-MSC soit de tissu pulmonaire ou fluide. Celles-ci varient de cellules activées par fluorescence (FACS) méthodes basées sur la sélection de CD31 ^– / CD45 ^{– /} CD90 ⁺ des cellules ^7, CD31 ^{– /} CD45 ^{– /} épithéliale molécule d'adhésion cellulaire (EpCAM) – / Sca-1 + Cellules ^8, multirésistance transporteur ATP binding cassette G (ABCG2) cellules positives ⁹ ou colorant Hoechst 33342 efflux ^10, à l'adhésion et la migration en plastique ^11,12 sur tissu haché ^13.

Les avantages du procédé de ce document sont présentés plusieurs fois. En utilisant une digestion enzymatique doux et gradient de densité ^14, on obtient toutes les cellules de la plage de densité qui incluent MSC, mais excluent les cellules épithéliales ou endothéliales. L'étape suivante en plastique d'adhérence assure que seul le mesenchcellules ymal adhérer et de rester dans la culture, ce qui élimine les leucocytes. Mais plus important encore, l'étape de sélection CD146 ⁺ permet l'élimination des fibroblastes, car ces cellules n'expriment CD146. Expression de la molécule d'adhésion des cellules CD146 est positivement corrélée avec multipotence, et est donc un bon marqueur pour éliminer les fibroblastes à partir d'une population de cellules mésenchymateuses ^15-19. Ceci est un avantage par rapport à l'aide de CD90 en tant que marqueur de sélection, tel qu'il est exprimé non seulement dans le MSC, mais aussi dans lipofibroblasts ^5,20. Dans ce protocole, nous avons explicitement choisi une sélection de billes magnétiques, car il est plus doux sur les cellules, et l'ensemble de la procédure peut se faire dans des conditions stériles. Un autre avantage important de ce procédé d'isolement, par opposition à la méthode de l'excroissance, est qu'il est relativement rapide, 6-10 jours par opposition à un mois ou plus pour le procédé de l'excroissance. Trois à cinq jours après l'isolement initial la population mésenchymateuses est prêt pour CD146 ⁺ sele ction; après trois à cinq jours, les cellules CD146 ⁺ sont prêts à être utilisés pour des expériences ou peuvent être congelés pour une utilisation ultérieure. Diminution du temps de culture améliore la qualité des cellules comme les fibroblastes MSC vers transdifférencier prolongée dans la culture ¹⁹ ex vivo. Enfin, en raison de la nature du protocole, il est possible d'appliquer ce procédé à d'autres espèces en choisissant simplement anticorps appropriés, ou même à d'autres systèmes d'organes en réglant le choix des enzymes de digestion et le temps d'incubation.

Un protocole détaillé de ce procédé d'isolement est donnée ci-dessous, et une vue d'ensemble schématique de l'isolement et de la sélection ultérieure de la sous-population CD146 ⁺ est fourni à la figure 1A et 1B, respectivement. En outre, les détails sont inclus pour des passages, la congélation et la décongélation de ces cellules.

ad / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Figure 1. Vue d'ensemble schématique de l'isolement des cellules pulmonaires mésenchymateuses (A) et CD146 ⁺ subséquente sélection de cellule (B) min = minutes. EDTA = acide éthylène diamine; ^{2 e} Ab = anticorps secondaire; a-CD146 Ab = anticorps anti-CD146 primaire; ve = cellules CD146 négatives des cellules; + ve cellules positives cellules = CD146. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de l'Université d'Ottawa (protocole d'éthique animale IRHO-1696). soins aux animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles. 1. Isolement des cellules mésenchymateuses du poumon stromales Préparer le mélange d'enzymes dans un tube de 50 ml: peser 30 U protéase neutre, 2500 U collagénase I et 500 U DNAse I. Ces montants suffisent pour les poumons d&…

Representative Results

Deux des caractéristiques physiques les plus fiables de MSC, la densité et l'adhésion en plastique, sont utilisés dans la première partie de ce protocole pour obtenir la fraction de cellules mésenchymateuses du poumon qui contient L-MSC. Bien que l'interphase à gradient de densité comprend des monocytes et des macrophages, en plus des cellules mésenchymateuses du poumon, l'adhérence plastique suivie par 3-5 jours de culture garantit que seules les cellules mésenchy…

Discussion

L'isolement et la culture de la primaire L-MSC présente une occasion de mieux comprendre leur fonction et de leur interaction avec d'autres populations de cellules à un niveau cellulaire, et leur rôle dans le développement des poumons, de la santé et de la maladie. Ceci est particulièrement important que l'absence d'un marqueur unique spécifique de ces cellules, il est presque impossible d'étudier ces cellules in situ. Comme pour toutes les populations de cellules primaires, il faut …

Materials

Neutral Protease	Worthington Biochemical Corporation	LS02104	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Collagenase I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl)	Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland	–	Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose	Life Technologies	14287-072	Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)	GE Healthcare	17-5446-52	Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	Warm in 37oC water bath before use
200 mM L-Glutamine	Life Technologies	25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062	Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG	Dako, Agilent Technologies	E0464	Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet	Life Technologies	12303D	Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE
anti-rat CD146 antibody	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution)	Bristol-Myers Squibb Canada	–	Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr.Frosty freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC