CD146 İzolasyonu<sup> +</supSıçan Akcigerlerinden> Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler
Summary
Bu protokol, enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma plastik uyumu ve CD146 + manyetik boncuk seçimi aracılığıyla, sıçanlardan primer akciğer yerleşik mezenkimal stromal hücreler elde etmek için bir izolasyon tekniği tarif etmektedir.
Abstract
Mezenkimal stromal hücreler (MKH) giderek akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere, hastalıkların geniş bir yelpazede terapötik potansiyeli için tanınır. kemik iliği ve eksojen hücre tedavisinde göbek kordonu MKH kullanımı yanında, aynı zamanda yerleşik doku MKH tamir ilgi ve rejeneratif potansiyeli artmaktadır. Ayrıca, büyük olasılıkla normal organ gelişiminde rol var ve hastalık rolleri, bir fibrotik doğa ile özellikle atfedilmiştir. Bu yerleşik doku MKH çalışmanın ana engel bu hücrelerin izolasyonu ve tanımlanması için net bir belirteç olmaması. Burada anlatılan izolasyon tekniği akciğer ikamet MSC (L-MKH) birden özelliklerini uygular. sıçanların kurban üzerine, akciğerler çıkarıldı ve kan kaldırmak için birden çok kez durulanır. neşter mekanik ayrışma ardından, akciğerler kollajenaz tip I, nötr proteaz ve DNaz tip I obtaine bir karışımını kullanarak 2-3 saat sindirilirD tek bir hücre süspansiyonu daha sonra yıkandı ve yoğunluk gradyan ortamı (yoğunluk 1.073 g / ml) üzerine yayıldı. Santrifüj işleminden sonra, interfaz gelen hücreler yıkanır ve kültürü ile işlenmiş balonlarına kaplanmıştır. Hücreler, fizyolojik,% 5 O2 4-7 gün% 5 CO2 şartları için kültürlenir. Fibroblastlar (CD146 -) tüketmek ve CD146 + hücreleri yalnızca L-MSC'ler (CD146 +), pozitif seçim popülasyonu sağlamak için manyetik boncuk seçim yoluyla gerçekleştirilir. Özet olarak, bu prosedür, güvenli başka in vitro çalışma ve işleme için primer L-MSC nüfusu üretir. Çünkü protokol doğası, kolayca diğer deneysel hayvan modellerinde tercüme edilebilir.
Introduction
Mezenkimal stromal hücreler (MKH) giderek akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere, hastalıkların geniş bir yelpazede terapötik potansiyeli için tanınır. kemik iliği ve eksojen hücre tedavisinde göbek kordonu MKH kullanımı yanında, aynı zamanda yerleşik doku MKH tamir ilgi ve rejeneratif potansiyeli artmaktadır. gelişimi sırasında, akciğer olmak üzere, mezenşimin gelişimsel ipuçları önemli bir kaynak olduğunu ve yerleşik MKH bu merkezinde olması olası bir aday vardır. Ayrıca, kanıtlar ikamet MKH kanser 1,2 ve fibrozis 3 de dahil olmak üzere, yetişkin hastalıkları altüst ortaya çıkmaktadır. Bu yerleşik doku MKH çalışmanın ana engel bu hücrelerin 4 izolasyonu ve tanımlanması için net bir belirteç olmaması. Kök hücre antijenini-1 (Sca-1) doku kök hücrelerin bir çeşitliliği için bir markör olarak farelerde tespit edilmiştir, ve L-MSC 5 izole edilmesi için de kullanılabilir, ancak ne yazık varBaşka bir tür 6 ortologlarını da bilinir. Araştırmacılar akciğer dokusu ya da sıvı ya da L-MSC izolasyonu için farklı yalıtım çeşitli yöntemler bildirilmiştir. / CD45 – / – CD90 + hücreleri 7, CD31 – / CD45 – / epitelyal hücre yapışma molekülü (EpCAM) – Bu, CD31 seçilmesi (FACS) göre yöntem flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması değişir / Sca-1 + hücreleri 8, çok ilaca dirençli taşıyıcı kıyılmış dokusu 13 takım plastik bağlılık 11,12 ve göç ATP bağlayıcı kaset G (ABCG2) pozitif hücreler 9 veya Hoechst 33.342 boya efflux 10.
Burada sunulan yöntemin avantajı pek çok kat bulunmaktadır. Yumuşak enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanı 14 kullanılarak, tek bir MKH'lerin arasında, ancak epitelial veya endotelial hücreleri hariç yoğunluğu aralığının tüm hücreleri elde edilir. sonraki plastik bağlılık adım sadece mesench sağlarymal hücreleri lökosit ortadan kaldırarak, yapışır ve kültür kalmak. Bu hücreler CD146 ifade yok gibi en önemlisi, ancak CD146 + seçim aşaması, fibroblast ortadan kaldırılması için izin verir. Hücre yapışma molekülü CD146 ekspresyonu pozitif multipotency ile ilişkilidir ve bir mezenkimal hücre popülasyonu 15-19 den fibroblastlar ayıklamak için iyi bir belirteç etmektir. Sadece MSC değil, aynı zamanda lipofibroblasts 5,20 ifade edilmediği gibi bu, bir seçme markeri olarak CD90 ile bir avantajdır. o hücreler üzerinde nazik olduğu gibi bu protokolde açıkça, bir manyetik boncuk seçimi seçmiş ve tüm prosedür steril şartlarda yapılabilir. sonucudur yönteme karşı, bu izolasyon yönteminin bir başka önemli avantajı, sonucudur yöntemi için bir ay ya da daha fazla karşı bu 6-10 gün, nispeten hızlı olmasıdır. Üç beş gün ilk izolasyondan sonra mezenkimal nüfus CD146 + sele hazır ction; Başka bir üç ila beş gün sonra CD146 + hücreleri deneyler için kullanılmaya hazır ya da daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. MKH uzun ex vivo kültür 19 fibroblastlar doğru transdifferentiate olarak kültür azalmış zaman hücrelerinin kalitesini artırır. Son olarak, çünkü protokol doğası, sindirim enzimleri ve inkübasyon süresi seçilerek ayarlanması ile diğer organ sistemleri sadece uygun antikorlar seçerek veya hatta diğer türler için bu yöntemi uygulamak mümkündür.
Bu izolasyon yönteminin ayrıntılı bir protokol aşağıda verilmiştir ve izolasyon ve CD146 + alt populasyonun sonraki seçimi genel şematik bir görünümüdür, sırasıyla Şekil 1 A ve 1 B 'de verilmektedir. Ayrıca, ayrıntıları bu hücrelerin dondurulması ve çözülmesi, geçiş için dahil edilmiştir.
reklam / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
. Pulmoner mezenkimal hücreler (A) ve daha sonraki CD146 + hücre seçimi (B) min = dakika izolasyonu Şekil 1. Şematik genel bakış; EDTA = Etilendiamintetraasetik asit; 2. Ab = ikincil antikor; a-CD146 antikor = birincil anti-CD146 antikor; -ve hücreleri = CD146 negatif hücrelerin; + hücreler = CD146 pozitif hücreler ettik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birincil L-MKH izolasyonu ve kültürü daha iyi işlev ve hücresel düzeyde diğer hücre popülasyonlarının ile olan etkileşimlerini ve akciğer gelişimi, sağlık ve hastalık rollerini anlamak için bir fırsat sunuyor. Bu, belirli bir hücre tek işaretleyici olmaması neredeyse imkansız yerinde bu hücrelerin çalışma yapar, bu özellikle önemlidir. Tüm ilköğretim hücre popülasyonlarının olduğu gibi, kimse bu hücreler (24 gözden) kültür 19 tutulur artık onların…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation – Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children’s Hospital of Eastern Ontario Research Institute.
Materials
| Neutral Protease | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| Collagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| Pentobarbital sodium (Euthanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland | – | Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more. |
| Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose | Life Technologies | 14287-072 | Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC. |
| αMEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Warm in 37oC water bath before use |
| 200 mM L-Glutamine | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | Penicillin/Streptomycin/Fungizone |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Magnetic beads |
| biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below |
| DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE |
| anti-rat CD146 antibody | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12.5 μl per 0.5 x 106 cells |
| Pentaspan (pentastarch solution) | Bristol-Myers Squibb Canada | – | Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl. |
| Mr.Frosty freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC |
References
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
- Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
- Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
- McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
- Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer–different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
- Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , (2011).
- Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
- Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
- Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
- Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
- Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
- Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
- Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
- Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
- Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
- Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
- Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
- McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
- Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
- Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498 (2009).
- Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
- Respiratory Physiology. UCL Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015)
- Boron, W. F., Boulpaep, E. L. . Medical Physiology. 2nd edn. , (2009).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
- Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
- Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
- Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
- Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
- Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
- Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
- Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
- Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
- Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
- da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
- McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
- Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
- Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
- Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
- Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).
