CD146의 분리<sup> +</sup쥐 폐에서> 주민 폐 중간 엽 기질 세포
Summary
이 프로토콜은 소화 효소, 밀도 구배 분리, 수지 밀착성 및 CD146 + 자성 비드의 선택을 이용하여, 래트에서 일차 폐 상주 간엽 기질 세포를 얻기위한 분리 기술을 설명한다.
Abstract
중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 점점 폐 질환을 포함한 질병의 넓은 범위에서 자신의 치료 가능성을 인정 받고 있습니다. 골수 및 외인성 세포 치료를위한 제대혈 중간 엽 줄기 세포의 사용 외에, 또한 주민 조직 중간 엽 줄기 세포의 복구에 대한 관심과 회생 가능성이 증가하고있다. 또한, 그들은 가능성이 정상 장기 발전에 역할을, 질병의 역할, 섬유 성 자연과 특히 때문이라고했다. 이러한 상주 조직 엽 줄기 세포의 연구를위한 주요 장애물은 이러한 세포의 분리 및 식별을위한 명확한 마커의 부족이다. 여기에 설명 된 분리 기술은 폐 상주 중간 엽 줄기 세포 (L-중간 엽 줄기 세포)의 여러 특성을 적용합니다. 쥐의 희생에, 폐를 제거하고 혈액을 제거하기 위해 여러 번 세척한다. 메스에 의한 기계적 해리 후에, 폐 콜라겐 타입 I, 중성 프로테아제 및 DNase의 유형 I. obtaine의 혼합을 사용하여 2-3 시간 동안 소화D는 단일 세포 현탁액을 연속적으로 세척하고, 밀도 구배 배지 (밀도 1.073 g / ㎖) 위에 적층된다. 원심 분리 후, 계면에서 세포를 세척 및 문화 처리 된 플라스크에 도금. 세포는 생리 5 % O 2 4 내지도 7 일간 5 % CO 2 조건에서 배양했다. 섬유 아 세포 (CD146을 -) 고갈 및 CD146 + 세포 만 L-중간 엽 줄기 세포 (CD146 +), 긍정적 인 선택의 인구를 보장하기 위해 자기 비드 선택을 통해 수행된다. 요약하면,이 절차는 확실하게 더 시험관 연구와 조작을위한 기본 L-중간 엽 줄기 세포의 인구를 생성합니다. 때문에 프로토콜의 특성 때문에 용이하게 다른 실험 동물 모델로 변환 할 수있다.
Introduction
중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 점점 폐 질환을 포함한 질병의 넓은 범위에서 자신의 치료 가능성을 인정 받고 있습니다. 골수 및 외인성 세포 치료를위한 제대혈 중간 엽 줄기 세포의 사용 외에, 또한 주민 조직 중간 엽 줄기 세포의 복구에 대한 관심과 회생 가능성이 증가하고있다. 개발하는 동안, 폐 비롯한 중간 엽 발달 큐의 중요한 원천이며, 거주자 엽 줄기 세포는이 중심에있을 가능성의 후보이다. 또한, 증거는 상주 중간 엽 줄기 세포가 암 1, 2, 3 섬유증을 포함한 성인병에 교란되는 부상하고있다. 이러한 상주 조직 엽 줄기 세포의 연구를위한 주요 장애물이 셀 (4)의 분리 및 식별을위한 명확한 마커의 부족이다. 줄기 세포 항원 1 SCA (1)의 조직 줄기 세포의 다양한 마커로서 마우스에서 확인하고, L-5 엽 줄기 세포의 분리를 위해 사용될 수 있지만, 불행하게도 갖는다다른 종 6 orthologs은 알려진 바 없음. 연구팀은 폐 조직 또는 유체 중 하나에서 L-중간 엽 줄기 세포의 분리를위한 다른 분리 다양한 방법을보고했다. / CD45 – – / CD90 + 세포 (7), CD31 – / CD45 – / 상피 세포 부착 분자 (는 EpCAM) -이 CD31에 대한 선택 (FACS) 기반 방법 정렬 형광 활성화 세포 다를 / 무서-1 + 세포 8 약제 내성 트랜스 다진 조직 (13) 중 플라스틱 부착 11, 12 및 마이그레이션에 ATP 바인딩 카세트 G (ABCG2) 양성 세포 9 훽스트 33342 염료 유출 10.
본원에 제시된 방법의 장점은 여러 배이다. 부드러운 효소 소화와 밀도 구배 (14)를 사용함으로써, 하나의 중간 엽 줄기 세포를 포함하지만, 상피 세포 또는 내피 세포를 제외 밀도 범위의 모든 세포를 얻는다. 후속 플라스틱 접착 공정 만 mesench 보장ymal 세포는 백혈구를 제거, 준수 문화를 유지. 이들 세포는 CD146을 발현하지 않는 가장 중요하지만, CD146 + 선택 단계는 섬유 아세포의 제거를 허용한다. 세포 부착 분자 CD146의 발현 양 능성과 상관되고, 중간 엽 세포 집단 15-19에서 섬유 아세포를 걸러 좋은 마커 따라서이다. 그것만 엽 줄기 세포뿐만 아니라 lipofibroblasts 5,20에서 발현되지 않기 때문에 이는 선별 마커로서 CD90을 사용 위에 이점이다. 이 세포에 완만으로이 프로토콜에서 우리는 명시 적으로, 자기 비드 선택을 선택했으며, 전체 절차는 무균 상태에서 수행 할 수 있습니다. 가지 방법과 반대로,이 분리 방법의 다른 중요한 이점은 가지 방법에 대해 개월 이상의 대향로 6-10 일 비교적 빠른 점이다. 3 ~ 5 일 초기 격리 후 중간 엽 인구는 CD146 + 실리 준비가 ction; 다른 3-5일 후 CD146 + 세포는 실험에 사용될 준비가 이후 사용을 위해 고정 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포는 장기간의 체외 배양 (19)의 섬유 아세포으로 transdifferentiate로 문화의 감소 시간은 세포의 품질을 향상시킵니다. 마지막으로 인해 프로토콜의 특성으로 인해 소화 효소와 인큐베이션 시간의 선택을 조정함으로써, 다른 기관계를 단순히 적절한 항체를 선택하는, 또는에 의해 다른 종에이 방법을 적용하는 것이 가능하다.
이 분리 방법의 상세한 프로토콜은 아래와되고, 분리 및 CD146 + 아군 후속 선택의 개략도는 각각도 1a 및 1b에 제공된다. 또한, 세부 사항은이 세포를 냉동과 해동, 계대 포함되어 있습니다.
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. 폐 중간 엽 세포 (A) 및 후속 CD146 + 세포 선택 (B) 분 = 분 격리 그림 1. 개요도; EDTA = 에틸렌 디아민 테트라 아세트산; 2 차 순이 = 차 항체; α-CD146 순이 = 차 항 CD146 항체; – 제가 세포 = CD146 부정적인 세포; + 세포 = CD146 양성 세포를했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
차 L-중간 엽 줄기 세포의 분리 및 배양은 더 나은 자신의 기능과 세포 수준에서 다른 세포 집단과의 상호 작용, 폐 개발, 건강과 질병에서의 역할을 이해 할 수있는 기회를 제공합니다. 이들 세포의 특정 단일 마커의 부족이 거의 불가능 반응계에서 이들 세포를 연구 할 수있다 이것은 특히 중요하다. 모든 기본 세포 집단과 마찬가지로, 하나는 이러한 세포들이 (24에서 검토) 문화 <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation – Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children’s Hospital of Eastern Ontario Research Institute.
Materials
| Neutral Protease | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| Collagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| Pentobarbital sodium (Euthanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland | – | Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more. |
| Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose | Life Technologies | 14287-072 | Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC. |
| αMEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Warm in 37oC water bath before use |
| 200 mM L-Glutamine | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | Penicillin/Streptomycin/Fungizone |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Magnetic beads |
| biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below |
| DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE |
| anti-rat CD146 antibody | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12.5 μl per 0.5 x 106 cells |
| Pentaspan (pentastarch solution) | Bristol-Myers Squibb Canada | – | Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl. |
| Mr.Frosty freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC |
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