Isolering av CD146⁺ Resident Lung Mesenchymale stromale celler fra Rat Lunger

Summary

Denne protokollen beskriver en isolasjons teknikk for å oppnå primær lunge hørende mesenchymal stromale celler fra rotter, ved bruk av enzymatisk fordøyelse, tetthetsgradient separasjon, plast tilslutning og CD146 ⁺ magnetiske kuler utvalg.

Abstract

Mesenchymale stromale celler (MSC) er i økende grad anerkjent for deres terapeutiske potensial i et bredt spekter av sykdommer, inkludert lungesykdommer. I tillegg til bruk av benmarg og navlestreng MSC for eksogene celleterapi, er det også økende interesse for reparasjon og regenerativ potensialet bosatt vev MSC. Dessuten har de sannsynligvis ha en rolle i normal organutvikling og er blitt tilskrevet roller i sykdommer, spesielt de med en fibrotisk natur. Den største hinder for studiet av disse hørende vev MSCer er mangelen på en klar markør for isolering og identifisering av disse cellene. Isolasjon teknikken beskrevet her gjelder flere kjennetegn ved lunge bosatt MSC (L-MSC). Etter ofring av rottene blir lunger ble fjernet og skyllet flere ganger for å fjerne blod. Etter mekanisk dissosiasjon av skalpellen, er lungene spaltet i 2-3 timer ved bruk av en blanding av kollagenase type I, nøytral protease og DNase type I. Det som ble oppnåddd enkeltcelle-suspensjon ble deretter vasket og lagt over tettshetsgradient medium (densitet 1,073 g / ml). Etter sentrifugering blir cellene fra den inter vasket og sådd ut i kultur-behandlede kolber. Celler dyrkes i 4-7 dager i fysiologisk 5% _O2, 5% _CO2-forhold. Å utarme fibroblaster (CD146 ^-) og for å sikre en befolkning på bare L-MSC (CD146 ^+), positiv utvelgelse for CD146 ^{+ celler} utføres gjennom magnetiske kuler utvalg. Oppsummert produserer denne prosedyren pålitelig en befolkning på primær L-MSC for videre in vitro studier og manipulasjon. På grunn av naturen av protokollen, kan det lett bli oversatt til andre eksperimentelle dyremodeller.

Introduction

Mesenchymale stromale celler (MSC) er i økende grad anerkjent for deres terapeutiske potensial i et bredt spekter av sykdommer, inkludert lungesykdommer. I tillegg til bruk av benmarg og navlestreng MSC for eksogene celleterapi, er det også økende interesse for reparasjon og regenerativ potensialet bosatt vev MSC. Under utviklingen, blant annet i lungene, er det mesenchyme en viktig kilde til utviklings signaler, og bosatt MSC er en sannsynlig kandidat til å være i sentrum for dette. Videre er bevis dukker opp som ilegges MSC er gjennomtrengt på voksne sykdommer, inkludert kreft ^1,2 og fibrose ^tre. Den største hinder for studiet av disse hørende vev MSCer er mangelen på en klar markør for isolering og identifisering av disse cellene ^4. Stamcelle antigen-1 (Sca-1) ble identifisert i mus som en markør for en rekke forskjellige vev stamceller, og kan anvendes for isolering av L-MSC ^5, men har dessverreingen kjent ortologer i andre arter ^6. Forskere har rapportert en rekke forskjellige isoleringsmetoder for isolering av L-MSC enten fra lungevev eller væske. Disse varierer fra fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) baserte metoder som selekterer for CD31 ^– / CD45 ^– / CD90 ⁺ celler ^7, CD31 ^– / CD45 ^– / epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) – / Sca-1 + -celler ^{til 8,} multiresistens transporter ATP bindende kassett G (ABCG2) positive celler ⁹ eller Hoechst 33342 fargestoff utstrømming ^10, til plast etterlevelse ^11,12 og migrasjon ut av hakket vev ^13.

Fordelene med den her presenterte fremgangsmåten er flere ganger. Ved hjelp av en svak enzymatisk fordøyelse og tetthetsgradient ^14, får man alle cellene i tetthetsområdet som inkluderer MSC men ekskluderer epitelceller eller endotelceller. Den påfølgende plast adherenstrinn sikrer at bare den mesenchymal cellene holder seg og bo i kultur, eliminere leukocytter. Viktigst er imidlertid lar CD146 ⁺ seleksjonstrinnet for eliminering av fibroblaster, da disse celler ikke uttrykker CD146. Ekspresjon av celleadhesjonsmolekyl CD146 er positivt korrelert med multipotency, og er derfor en god markør for å luke ut fibroblaster fra en mesenchymale cellepopulasjon ^15-19. Dette er en fordel i forhold til å bruke CD90 som en seleksjonsmarkør, som det ikke er bare uttrykt i MSC men også i lipofibroblasts ^5,20. I denne protokoll har vi eksplisitt valgt en på magnetiske kuler valg, som det er mildere på cellene, og hele prosedyren kan utføres i sterile betingelser. En annen viktig fordel med denne isolasjonsmetoden i motsetning til den utvekst metode, er at det er forholdsvis rask, 6-10 dager i motsetning til en måned eller mer for utveksten metode. Tre til fem dager etter den første isolering av mesenchymale befolkningen er klar for CD146 ⁺ sele Dette skjer; etter ytterligere tre til fem dager CD146 ⁺ cellene er klare til å bli brukt til eksperimenter eller kan bli frosset for senere bruk. Den reduserte tiden av kultur forbedrer kvaliteten på cellene som MSC transdifferentiate mot fibroblaster i forlenget ex vivo kultur ^19. Til slutt, på grunn av naturen av protokollen, er det mulig å anvende denne fremgangsmåte for andre arter ved ganske enkelt å velge egnede antistoffer, eller til og med til andre organsystemer ved å justere valg av fordøyelsesenzymer og inkubasjonstid.

En detaljert protokoll av denne isolasjonsmetoden er gitt nedenfor, og en skjematisk oversikt over isolasjon og påfølgende valg av CD146 ⁺ undergruppe er gitt i Figur 1A og 1B henholdsvis. I tillegg er detaljer inkludert for aging, frysing og tining disse cellene.

ad / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk oversikt over isolasjonen av pulmonale mesenchymale celler (A) og etterfølgende CD146 ⁺ valget av celler (B), min = minutter.; EDTA = Ethylenediaminetetraacetic syre; ^2. Ab = sekundært antistoff; a-CD146 Ab = primære anti-CD146 antistoff; ve celler = CD146 negative celler; + ve celler = CD146-positive celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av Animal Care komité University of Ottawa (dyreetikk protokollen Ohrí-1696). Dyr behandling ble utført i samsvar med institusjonens retningslinjer. 1. Isolering av Lung Mesenchymale stromale celler Forbered enzymet blandingen i en 50 ml tube: veie 30 U nøytral Protease, 2500 U Collage I og 500 U DNAse I. Disse beløpene nok for lungene til en voksen mus eller rotte valp. Forbered på dag av isolasjon og oppbevares ved 4 ° C inntil bruk. …

Representative Results

To av de mest pålitelige fysiske egenskapene til MSC, tetthet og plast tilslutning, blir brukt i den første del av denne protokollen for å oppnå den mesenchymale cellefraksjon i lungene som inneholder L-MSC. Selv om densitetsgradient mellomfase vil omfatte monocytter og makrofager i tillegg til lunge mesenchymale celler, plast tilslutning fulgt av 3-5 dagers dyrking sørger for at bare de lunge mesenchymale celler forbli. Faktisk denne cellen befolkningen uttrykker de klassiske MSC o…

Discussion

Isolering og kultur av primær L-MSC presenterer en mulighet til å bedre forstå deres funksjon og deres samspill med andre cellepopulasjoner på cellenivå, og deres rolle i lunge utvikling, helse og sykdom. Dette er særlig viktig som mangel på en spesifikk markør enkelt av disse cellene gjør det nesten umulig å studere disse cellene in situ. Som med alle primære cellepopulasjoner, bør man huske på at disse cellene er mer sannsynlig å endre sin karakter jo lengre de blir holdt i kultur ¹⁹ …

Materials

Neutral Protease	Worthington Biochemical Corporation	LS02104	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Collagenase I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl)	Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland	–	Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose	Life Technologies	14287-072	Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)	GE Healthcare	17-5446-52	Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	Warm in 37oC water bath before use
200 mM L-Glutamine	Life Technologies	25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062	Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG	Dako, Agilent Technologies	E0464	Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet	Life Technologies	12303D	Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE
anti-rat CD146 antibody	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution)	Bristol-Myers Squibb Canada	–	Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr.Frosty freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC