JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Forstærkning, Næste generations sekventering, og Genomisk DNA Kortlægning af retroviral integration steder

Published: March 22, 2016
doi:
10.3791/53840
, ,
1Department of Cancer Immunology and AIDS,Dana-Farber Cancer Institute, 2Chromatin Structure and Mobile DNA,The Francis Crick Institute

Summary

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Abstract

Retrovira udviser signatur integration præferencer på både lokale og globale skalaer. Her præsenteres en detaljeret protokol for (1) frembringelsen af ​​diverse biblioteker af retroviral integration websteder ved hjælp ligering-medieret PCR (LM-PCR) amplifikation og næste generation sekventering (NGS), (2) at kortlægge genomiske placering af hver virus- vært krydset ved hjælp BEDTools, og (3) at analysere dataene for statistisk relevans. Genomisk DNA ekstraheret fra inficerede celler er fragmenteret ved spaltning med restriktionsenzymer eller ved lydbehandling. Efter passende DNA ende-reparation, er dobbeltstrengede linkere ligeret på den DNA-ender, og semi-nested PCR udføres under anvendelse af primere komplementære til både den lange terminale gentagelse (LTR) ende af virusset og ligeret linker-DNA. PCR-primerne bærer sekvenser, der kræves til DNA-klyngedannelse under NGS, at bevirke kravet om separat adapter ligering. Kvalitetskontrol (QC) udføres for at vurdere DNA-fragment størrelsesfordeling og tilpasseare DNA inkorporering før NGS. Sequence output filer filtreres for LTR-holdige læser, og sekvenserne definerer LTR og linker er beskåret væk. Trimmede værtscellelinier sekvenser kortlægges til en reference-genom ved hjælp BLAT og filtreres til minimalt 97% identitet med et unikt sted i henvisningen genomet. Unikke integration steder er gransket for tilstødende nukleotid (nt) sekvens og distribution i forhold til forskellige genomiske funktioner. Ved anvendelse af denne protokol, kan integrationssted biblioteker af høj kompleksitet konstrueres fra genomisk DNA i tre dage. Hele protokol, som omfatter eksogen viral infektion af modtagelige vævskulturceller til integrationssted analyse kan derfor udføres i cirka en til to uger. Nylige anvendelser af denne teknologi vedrører langsgående analyse af integration steder fra HIV-smittede patienter.

Introduction

Integration af viralt DNA (vDNA) i værtscellens genom er et væsentligt skridt i den retrovirale livscyklus. Integration opnås ved den virale enzym integrase (IN), som udfører to forskellige katalytiske processer, der fører til etablering af stabilt indsat provirus 1. I underenheder i indgreb med enderne af det lineære vDNA, der genereres gennem revers transkription, danner den højere ordens intasome med vDNA ender holdes sammen af en IN multimer 2-4. I spalter 3 'enderne af vDNA nedstrøms fra invariante 5'-CA-3' sekvenser i en proces kendt som 3'-behandling, hvilket efterlader forsænkede 3'-ender med reaktive hydroxylgrupper ved hver vDNA terminus 5-8. Den intasome efterfølgende importeres til kernen som en del af en stor samling af vært og virale proteiner kendt som preintegration kompleks (PIC) 9-11. Efter at støde cellulære mål-DNA (tDNA), IN bruger vDNA 3'-hydroxyl groups for at spalte tDNA øverste og nederste tråde i en forskudt måde og samtidig slutter sig til vDNA til tDNA 5 'phosphatgrupperne gennem processen med streng transfer 12,13.

Retrovirus udstille integration foretrukne indstillinger på webstedet på de lokale og globale skalaer. Lokalt, konsensus integrationssteder består af svagt konserverede palindrome tDNA sekvenser, der spænder fra ca. fem til ti bp opstrøms og nedstrøms fra vDNA insertionssteder 14,15. Globalt retrovirus målrette specifikke kromatin anmærkninger 16. Der er syv forskellige retroviral slægter – alpha gennem epsilon, Lenti, og spuma. De lentivira, som omfatter HIV-1, favorisere integration i ligene af aktivt transskriberede gener 17, mens gammaretroviruses fortrinsvis integrere i transkriptionelle start-sites (TSSs) og aktive enhancerregioner 18-20. I skarp modsætning hertil spumavirus stærkt forudindtaget mod heterochromatiske regioner, såsom gen-fattig lamina-associerede domæner 21. Lokale tDNA base-præferencer er for en stor del dikteret af specifikke netværk af nukleoprotein- kontakter mellem IN og tDNA 13,22,23. For lentivira og gammaretroviruses, integration i forhold til genomiske anmærkninger er en stor del styret af interaktioner mellem IN og beslægtede cellulære faktorer 24-27. Ændring detaljerne i IN-tDNA interaktion netværk 13,22,23,28 og forstyrrer eller re-engineering IN-vært faktor interaktioner 25-27,29-32 er bevist strategier til retarget integration på lokalt og globalt plan, hhv.

Effekten af ​​DNA-sekventering procedurer, der anvendes til at katalogisere retroviral integration sites er steget enormt i de seneste årtier. Integration websteder blev genfundet i banebrydende arbejde ved hjælp af arbejdskrævende rensning og manuelle kloningsteknikker at give blot en håndfuld af unikke steder pr studiet 33,34.Kombinationen af LM-PCR-amplifikation af LTR-vært DNA vejkryds med evnen til at kortlægge individuelle integration websteder til menneskelige og mus udkast genomer forvandlet marken, med antallet af websteder genvundet fra eksogen vævskulturer celle infektioner stigende til flere hundrede til tusinder 17 , 18. Den nyere kombination af LM-PCR med NGS metodik har sendt bibliotek dybde skyrocketing. Konkret pyrosekventering gav på rækkefølgen af titusinder af unikke integration sites 30,35-38, mens biblioteker sekventeret ved brug af DNA-klyngedannelse kan give millioner af unikke sekvenser 19-21,39. Her beskriver vi en optimeret LM-PCR-protokol til forstærkning og sekventering retrovirale integration websteder ved hjælp af DNA-klyngedannelse NGS. Fremgangsmåden inkorporerer nødvendige adapter sekvenser i PCR-primerne og således direkte i det amplificerede DNA-molekyler, hvorved kravet til hinder for en ekstra adapter ligering trin før sequencing 40. Den bioinformatisk analyse rørledning fra parsing af rå sekventering data for LTR-værten DNA vejkryds til kortlægning af unikke integration sites for en iagttagelse genomiske funktioner, er også generelt beskrevet. I overensstemmelse med den forrang etableret fra tidligere metodiske protokoller på dette område 36,38,41-43, kan brugerdefinerede scripts blive udviklet til at hjælpe færdiggørelsen af konkrete skridt i bioinformatik pipeline. Anvendeligheden og følsomhed af protokollen er illustreret med repræsentative data ved at forstærke, sekventering og kortlægning HIV-1 integrationssteder fra vævskulturceller inficeret ved det omtrentlige infektionsmultiplicitet (MOI) på 1,0, samt en titrering serien af ​​dette DNA fortyndet gennem uinficerede cellulært DNA i 5-fold trin til en maksimal fortynding på 1: 15.625, hvilket gav den omtrentlige tilsvarende MOI på 6,4 x 10 -5.

Protocol

1. Generer Virus Stocks Bemærk: En rutediagram af den våde bænk aspekt af denne protokol er afbildet i figur 1 Detaljerne i viral stock produktion og efterfølgende infektion af vævskulturceller vil generelt finde anvendelse på forskellige typer af retrovira.. Til nogle forsøg kan målcellen ikke udtrykke det endogene viral receptor (er), og i sådanne tilfælde konstruktionen af pseudotype retrovirale partikler der huser heterologe virale kappeglycoprotein, f.eks</e…

Representative Results

Tabel 4 viser resultaterne af et repræsentativt eksperiment for at illustrere følsomheden af NGS til udvinding integrationssteder fra en kultur af inficerede celler. Uinficerede cellulært DNA blev anvendt til serielt fortyndet genomisk DNA fra en infektion, hvor hver celle i gennemsnit indeholdt én integration 40. Fortyndinger blev forberedt i trin på fem til en maksimal fortynding på 1: 15.625. Genomisk DNA i titreringsserie blev derefter fragmenteret v…

Discussion

En protokol til analyse af retroviral integration sites, fra den oprindelige virus infektion trin gennem kortlægning af genomiske distributionsmønstre, beskrives. Denne protokol gælder for enhver retrovirus og enhver inficeres celletype. Endvidere assayet rørledningen er meget følsomme, med potentiale til at genvinde en tilfredsstillende antal unikke integrationssteder fra serielle fortyndinger af genomisk DNA svarende til det af en infektion initieret med en MOI på 6,4 x 10 -5. Denne følsomhed er prot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er taknemmelige for vores kolleger Stephen Hughes og Henry Levin for rådgivning, der var afgørende for at etablere den NGS protokol for retroviral integration websted sekventering i Engelman lab. Dette arbejde blev støttet af amerikanske National Institutes of Health giver AI039394 og AI052014 (til ANE) og AI060354 (Harvard University Center for AIDS Research).

Materials

DMEM Gibco 11965-084 Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH 30088.03 Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production
Penicillin/Streptomycin Corning 30-002-Cl Antibiotics to be added to DMEM
Phosphate-buffered saline Mediatech 21-040-CV Used to wash cells
Trypsin EDTA Corning 25-053-CI Used to detach adherent cells from tissue culture plates
PolyJet SignaGen Laboratories SL100688 DNA transfection reagent
0.45 µm Filters Thermo Scientific 09-740-35B Used to filter virus particle-containing cell culture media
Turbo DNase Ambion AM2239 Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay ABL Inc. 5447 Used to quantify yield of virus production
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506 Used to purify genomic DNA from cells
Sonicator Covaris S2 With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec
Nuclease-Free Water GeneMate G-3250-125 Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Used to purify DNA during library construction
End-It DNA End-Repair Kit Epicentre ER81050 Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples
Klenow Fragment (3'-5' exo–) New England Biolabs (NEB) M0212S Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments
dATP Thermo Scientific R0141 Deoxyadenosine triphosphate
MseI NEB R0525L Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage
BglII NEB R0144L Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence
T4 DNA Ligase NEB M0202L/6218 Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends
DNA Oligonucleotides Integrated DNA Technologies custom Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs 
Advantage 2 Polymerase Mix Clontech 639202 Commercial mix containing DNA polymerase for PCR
dNTPs (100 mM solutions) Thermo Scientific R0181 Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP
NanoDrop Thermo Scientific NanoDrop 2000 Spectrophotometer for determination of DNA concentration
Qubit Fluorimeter Life Technologies Qubit® 3.0 Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration
2200 TapeStation System Agilent G2964AA Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution
MiSeq Illumina SY-410-1003 Used for NGS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890 (2012).
  2. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
  3. Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464, 232-236 (2010).
  4. Hare, S., Maertens, G. N., Cherepanov, P. 3′-processing and strand transfer catalysed by retroviral integrase in crystallo. EMBO J. 31, 3020-3028 (2012).
  5. Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54, 497-504 (1988).
  6. Roth, M. J., Schwartzberg, P. L., Goff, S. P. Structure of the termini of DNA intermediates in the integration of retroviral DNA: dependence on IN function and terminal DNA sequence. Cell. 58, 47-54 (1989).
  7. Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Retroviral integration: structure of the initial covalent product and its precursor, and a role for the viral IN protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 2525-2529 (1989).
  8. Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179, 886-889 (1990).
  9. Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3, 469-478 (1989).
  10. Bukrinsky, M. I., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 6580-6584 (1992).
  11. Miller, M. D., Farnet, C. M., Bushman, F. D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71, 5382-5390 (1997).
  12. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67, 1211-1221 (1991).
  13. Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468, 326-329 (2010).
  14. Holman, A. G., Coffin, J. M. Symmetrical base preferences surrounding HIV-1, avian sarcoma/leukosis virus, and murine leukemia virus integration sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 6103-6107 (2005).
  15. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M., Munroe, D. J. Weak palindromic consensus sequences are a common feature found at the integration target sites of many retroviruses. J. Virol. 79, 5211-5214 (2005).
  16. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42, 10209-10225 (2014).
  17. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  18. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
  19. LaFave, M. C., et al. MLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42, 4257-4269 (2014).
  20. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J. Virol. 88, 4504-4513 (2014).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523, 366-369 (2015).
  22. Serrao, E., et al. Integrase residues that determine nucleotide preferences at sites of HIV-1 integration: implications for the mechanism of target DNA binding. Nucleic Acids Res. 42, 5164-5176 (2014).
  23. Aiyer, S., et al. Structural and sequencing analysis of local target DNA recognition by MLV integrase. Nucleic Acids Res. 43, 5647-5663 (2015).
  24. Ciuffi, A., et al. A role for LEDGF/p75 in targeting HIV DNA integration. Nat. Med. 11, 1287-1289 (2005).
  25. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 12036-12041 (2013).
  26. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J. Virol. 87, 12721-12736 (2013).
  27. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell Rep. 5, 886-894 (2013).
  28. Demeulemeester, J., et al. HIV-1 integrase variants retarget viral integration and are associated with disease progression in a chronic infection cohort. Cell Host Microbe. 16, 651-662 (2014).
  29. Meehan, A. M., et al. LEDGF/p75 proteins with alternative chromatin tethers are functional HIV-1 cofactors. PLoS Pathog. 5, e1000522 (2009).
  30. Ferris, A. L., et al. Lens epithelium-derived growth factor fusion proteins redirect HIV-1 DNA integration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 3135-3140 (2010).
  31. Gijsbers, R., et al. LEDGF hybrids efficiently retarget lentiviral integration into heterochromatin. Mol. Ther. 18, 552-560 (2010).
  32. Aiyer, S., et al. Altering murine leukemia virus integration through disruption of the integrase and BET protein family interaction. Nucleic Acids Res. 42, 5917-5928 (2014).
  33. Jahner, D., Jaenisch, R. Integration of Moloney leukaemia virus into the germ line of mice: correlation between site of integration and virus activation. Nature. 287, 456-458 (1980).
  34. Stevens, S. W., Griffith, J. D. Human immunodeficiency virus type 1 may preferentially integrate into chromatin occupied by L1Hs repetitive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 5557-5561 (1994).
  35. Wang, G. P., Ciuffi, A., Leipzig, J., Berry, C. C., Bushman, F. D. HIV integration site selection: analysis by massively parallel pyrosequencing reveals association with epigenetic modifications. Genome Res. 17, 1186-1194 (2007).
  36. Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic Acids Res. 36, e49 (2008).
  37. Roth, S. L., Malani, N., Bushman, F. D. Gammaretroviral integration into nucleosomal target DNA in vivo. J. Virol. 85, 7393-7401 (2011).
  38. Ciuffi, A., Barr, S. D. Identification of HIV integration sites in infected host genomic DNA. Methods. 53, 39-46 (2011).
  39. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117, 3113-3122 (2011).
  40. Matreyek, K. A., et al. Host and viral determinants for MxB restriction of HIV-1 infection. Retrovirology. 11, 90 (2014).
  41. Ciuffi, A., et al. Methods for integration site distribution analyses in animal cell genomes. Methods. 47, 261-268 (2009).
  42. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39, e72 (2011).
  43. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol. Biol. 1185, 321-344 (2014).
  44. Page, K. A., Landau, N. R., Littman, D. R. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64, 5270-5276 (1990).
  45. Emi, N., Friedmann, T., Yee, J. K. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J. Virol. 65, 1202-1207 (1991).
  46. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
  47. Goff, S., Traktman, P., Baltimore, D. Isolation and properties of Moloney murine leukemia virus mutants: use of a rapid assay for release of virion reverse transcriptase. J. Virol. 38, 239-248 (1981).
  48. Willey, R. L., et al. In vitro mutagenesis identifies a region within the envelope gene of the human immunodeficiency virus that is critical for infectivity. J. Virol. 62, 139-147 (1988).
  49. Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nat. Med. 7, 631-634 (2001).
  50. Brussel, A., Sonigo, P. Analysis of early human immunodeficiency virus type 1 DNA synthesis by use of a new sensitive assay for quantifying integrated provirus. J. Virol. 77, 10119-10124 (2003).
  51. Serrao, E., Ballandras-Colas, A., Cherepanov, P., Maertens, G. N., Engelman, A. N. Key determinants of target DNA recognition by retroviral intasomes. Retrovirology. 12, 39 (2015).
  52. Maldarelli, F., et al. HIV latency. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345, 179-183 (2014).
  53. Wagner, T. A., et al. HIV latency. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345, 570-573 (2014).
  54. Cohn, L. B., et al. HIV-1 integration landscape during latent and active infection. Cell. 160, 420-432 (2015).
  55. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the QubitTM RNA HS assay using RNA spike-in. BMC Mol. Biol. 16, 9 (2015).
  56. Padmanaban, A., Walker, D. M. . Analysis of high molecular weight genomic DNA using the Agilent 2200 TapeStation and genomic DNA ScreenTape. Publication number 5991-1797EN Agilent Technologies. , (2013).
  57. . . Kapa library quantification technical guide version v1.14. , (2014).
  58. Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 12, 656-664 (2002).
  59. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  60. Gaur, M., Leavitt, A. D. Mutations in the human immunodeficiency virus type 1 integrase D,D(35)E motif do not eliminate provirus formation. J. Virol. 72, 4678-4685 (1998).
  61. Varadarajan, J., McWilliams, M. J., Hughes, S. H. Treatment with suboptimal doses of raltegravir leads to aberrant HIV-1 integrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 14747-14752 (2013).
  62. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12, 996-1006 (2002).
  63. Berry, C. C., et al. Estimating abundances of retroviral insertion sites from DNA fragment length data. Bioinformatics. 28, 755-762 (2012).
  64. Firouzi, S., et al. Development and validation of a new high-throughput method to investigate the clonality of HTLV-1-infected cells based on provirus integration sites. Genomic Med. 6, 46 (2014).
  65. Mitchell, R. S., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2, E234 (2004).
  66. Schneider, T. D., Stormo, G. D., Gold, L., Ehrenfeucht, A. Information content of binding sites on nucleotide sequences. J. Mol. Biol. 188, 415-431 (1986).
  67. Langmead, B. Chapter 11, Unit 11. 17, Aligning sort sequencing reads with Bowtie. Curr. Protoc. Bioinformatics. , (2010).
  68. LaFave, M. C., Varshney, G. K., Burgess, S. M. GeIST: a pipeline for mapping integrated DNA elements. Bioinformatics. 31, 3219-3221 (2015).
  69. Hocum, J. D., et al. VISA – Vector Integration Site Analysis server: a web-based server to rapidly identify retroviral integration sites from next-generation sequencing. BMC Bioinformatics. 16, 212 (2015).
  70. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15, 1431-1436 (2009).
  71. . . TruSeq Library Prep Pooling Guide. Guidelines for pooling TruSeq libraries for Illumina sequencing systems that require balanced index combinations. , (2015).

Tags

Keywords: AmplificationNext-generation SequencingGenomic DNA MappingRetroviral Integration SitesPCRDNA SequencingHEK293T CellsTransfectionVirus ConcentrationP24 AntigenCell Infection
check_url/53840?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Serrao, E., Cherepanov, P., Engelman, A. N. Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites. J. Vis. Exp. (109), e53840, doi:10.3791/53840 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image