レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング
Summary
We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.
Abstract
両方のローカルおよびグローバルなスケールでレトロウイルスの展示署名統合好み。ここでは、（2）各ウィルスのゲノムの位置をマッピングする、ライゲーション媒介PCR（LM-PCR）増幅および次世代シークエンシング（NGS）を使用して、レトロウイルス組込み部位の多様なライブラリーの（1）の生成のための詳細なプロトコルを提供しますBEDToolsを用いて接合をホストし、そして（3）統計的関連性のためにデータを分析します。感染細胞から抽出したゲノムDNAを制限酵素で、または超音波処理による消化によって断片化されます。適切なDNA末端修復した後、二本鎖リンカーは、DNAの末端にライゲーションされ、半ネステッドPCRは、ウイルスの長い末端反復（LTR）の端部と連結させたリンカーDNAの両方に相補的なプライマーを用いて行われます。 PCRプライマーは、別々のアダプターライゲーションのための要件を否定、NGS中にDNAのクラスタリングに必要な配列を運びます。品質管理（QC）は、DNA断片のサイズ分布を評価し、適応させるために行われますNGSの前にDNAの取り込みを小胞体。シーケンス出力ファイルは、LTR-含む読み込みのためにフィルタリングされ、及びLTRおよびリンカーを定義するシーケンスが離れてトリミングされます。トリミングされた宿主細胞の配列は、BLATを用いて基準ゲノムにマッピングされ、参照ゲノムにおけるユニークな点に最小限97％の同一性のためにフィルタリングされます。ユニークな組み込み部位は、様々なゲノム機能に隣接するヌクレオチド（nt）の配列および分布の相対のために精査されています。このプロトコルを使用して、高い複雑性の組込み部位のライブラリーは、三日中のゲノムDNAから構築することができます。組込み部位の解析に影響を受けやすい組織培養細胞の外因性のウイルス感染を包含する全体の手順は、従って、約1〜2週間で行うことができます。この技術の最近のアプリケーションでは、HIV感染患者からの組込み部位の長手方向の分析に関連しています。
Introduction
宿主細胞ゲノムへのウイルスDNA（vDNA）の統合は、レトロウイルスのライフサイクルに不可欠なステップです。統合を安定挿入プロウイルス1の確立につながる二つの異なる触媒プロセスを実行するウイルス酵素インテグラーゼ（IN）、によって達成されます。サブユニットにある多量2-4によって一緒に保持端vDNAと高次intasomeを形成し、逆転写により生成された線形vDNAの端部に係合します。切断する3'-処理として知られているプロセスにおける配列の3 '下流不変5'-CA-3からvDNAの'末端は、3 '陥凹残す各vDNA末端5-8で反 応性ヒドロキシル基で終わります。 intasomeは、その後、ホストの大規模アセンブリおよびプレインテグレーション複合体（PIC）9-11として知られているウイルスタンパク質の一部として核にインポートされます。細胞標的DNA（TDNA）が遭遇した後、INは3'-ヒドロキシルグロvDNAを使用しています同時に千鳥状にTDNAトップとボトム鎖を切断するアップとは、鎖転移12,13の過程を経てTDNA 5 'リン酸基にvDNAを結合します。
ローカルおよびグローバルなスケールでレトロウイルス展示組込み部位の好み。局所的には、コンセンサス組込み部位は、上流と下流のvDNA挿入部位14,15から約5〜10塩基対から及ぶ弱く保存されたパリンドロームTDNAの配列からなります。世界的に、レトロウイルスは特定のクロマチンの注釈16をターゲットにしています。イプシロン、レンチ、およびspumaを通じてアルファ – 7つの異なるレトロウイルス属があります。ガンマレトロが優先的に、転写開始部位（のTSS）とアクティブエンハンサー領域18-20に統合しながら、HIV-1を含むレンチウイルスは、積極的に転写される遺伝子17の本体内での統合を好みます。著しく対照的に、スプーマを強くheterochromに偏っていますこのような遺伝子に乏しいラミナ関連ドメイン21とATICの地域、。地元のTDNAの基本設定は、INとTDNA 13,22,23間の核の連絡先の特定のネットワークによって決定される大部分があります。レンチウイルス及びガンマレトロのために、ゲノムのアノテーションへの統合の相対は、INと同族の細胞因子24-27間の相互作用によって支配大部分です。因子の相互作用25-27,29-32は、それぞれ、ローカルおよびグローバルレベルでの統合を再ターゲットするための戦略を証明しているIN-ホストIN-TDNAの相互作用ネットワーク13,22,23,28の仕様を変更し、破壊し、またはリエンジニアリング。
レトロウイルスの組み込み部位をカタログするために使用するDNA配列決定手順のパワーは、過去数十年にわたって非常に増加しています。組込み部位は、研究33,34ごとにユニークなサイトのほんの一握りを得るために面倒な精製および手動クローニング技術を用いて、先駆的な仕事に回収しました。外因性の組織培養細胞の感染から回収サイトの数が数千17に数百に増加して、フィールドを形質転換したヒトおよびマウスのドラフトゲノムに個々の組込み部位をマッピングする機能を持つLTR-宿主DNA接合のLM-PCR増幅の組み合わせ、18。 NGSの方法論とLM-PCRのより最近の組み合わせは、ライブラリの深さ急騰を送信しました。 DNAのクラスタリングを使用することにより、配列決定ライブラリがユニークな配列19-21,39数百万を得ることができるしながら具体的には、パイロシーケンシングは、ユニークな組込み部位30,35-38数万のオーダーで得られました。ここでは、DNAのクラスタリングNGSを使用して、レトロウイルス組込み部位を増幅し、配列決定するための最適化されたLM-PCRプロトコルを記述します。この方法は、それによってsequenする前に、追加のアダプターライゲーション工程の必要性を排除し、直接増幅されたDNA分子に、したがって、PCRプライマーに必要なアダプター配列を組み込み、40を cing。 LTR-宿主DNA接合の生配列決定データの解析からのゲノムの機能を適切にする固有の組み込み部位のマッピングのバイオインフォマティクス解析パイプラインは、また、一般的に記載されています。この分野36,38,41-43における従来の方法論のプロトコルから確立された優先順位に応じて、カスタムスクリプトは、バイオインフォマティクスパイプライン内の特定のステップの完了を支援するために開発することができます。プロトコルの有用性および感度は、増幅することにより、代表的なデータで示さシーケンシング、および1.0の感染のおおよその多重度（MOI）、並びに、このDNAの滴定シリーズで感染組織培養細胞からのHIV-1組込み部位をマッピングしています6.4×10 -5のおおよそ同等のMOIを得15625：1の最大希釈の5倍ステップで非感染細胞DNAを介して希釈しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゲノムの分布パターンのマッピングを介して、最初のウイルス感染の段階からのレトロウイルス組込み部位の分析のためのプロトコルは、記載されています。このプロトコルは、任意のレトロウイルスと任意の感染可能細胞型にも適用可能です。さらに、アッセイパイプラインは、6.4×10 -5のMOIで開始感染のそれにゲノムDNAと同等の連続希釈液からのユニークな組込み部位の十分?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、エンゲルマンラボにおけるレトロウイルス組み込み部位の配列決定のためNGSプロトコルを確立することが重要であった助言のための私達の同僚スティーブン・ヒューズとヘンリー・レヴィンに感謝しています。この作品は、米国国立衛生研究所によってサポートされていましたAI039394とAI052014（ANE）とAI060354（エイズ研究のためのハーバード大学センター）を付与します。
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-084 | Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH 30088.03 | Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | Antibiotics to be added to DMEM |
| Phosphate-buffered saline | Mediatech | 21-040-CV | Used to wash cells |
| Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CI | Used to detach adherent cells from tissue culture plates |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | DNA transfection reagent |
| 0.45 µm Filters | Thermo Scientific | 09-740-35B | Used to filter virus particle-containing cell culture media |
| Turbo DNase | Ambion | AM2239 | Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks |
| HIV-1 p24 Antigen Capture Assay | ABL Inc. | 5447 | Used to quantify yield of virus production |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | Used to purify genomic DNA from cells |
| Sonicator | Covaris | S2 | With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec |
| Nuclease-Free Water | GeneMate | G-3250-125 | Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination |
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Used to purify DNA during library construction |
| End-It DNA End-Repair Kit | Epicentre | ER81050 | Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples |
| Klenow Fragment (3'-5' exo–) | New England Biolabs (NEB) | M0212S | Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments |
| dATP | Thermo Scientific | R0141 | Deoxyadenosine triphosphate |
| MseI | NEB | R0525L | Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage |
| BglII | NEB | R0144L | Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202L/6218 | Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends |
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | custom | Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs |
| Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639202 | Commercial mix containing DNA polymerase for PCR |
| dNTPs (100 mM solutions) | Thermo Scientific | R0181 | Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer for determination of DNA concentration |
| Qubit Fluorimeter | Life Technologies | Qubit® 3.0 | Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration |
| 2200 TapeStation System | Agilent | G2964AA | Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Used for NGS |
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