JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Published: March 22, 2016
doi:
10.3791/53840
, ,
1Department of Cancer Immunology and AIDS,Dana-Farber Cancer Institute, 2Chromatin Structure and Mobile DNA,The Francis Crick Institute

Summary

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Abstract

תערוכת Retroviruses העדפות אינטגרצית חתימה על המאזניים המקומיים ועולמיים כאחד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט (1) דור של ספריות מגוונות של אתרי אינטגרציה retroviral באמצעות בתיווך קשירת PCR (LM-PCR) הגברת רצף של הדור הבא (NGS), (2) מיפוי המיקום הגנומי של כל virus- לארח צומת באמצעות BEDTools, ו (3) ניתוח הנתונים עבור הרלוונטיות סטטיסטיות. הדנ"א הגנומי מופק בתאים נגועים מפוצל על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה או על ידי sonication. לאחר תיקון סוף DNA המתאים, linkers פעמים התקועות הוא ligated על DNA מסתיים, חצי מקונני PCR מתבצעת באמצעות פריימרים משלימים הוא חוזר מסוף הארוך (LTR) בסופו של הנגיף לבין DNA מקשר ligated. פריימרים PCR לבצע רצפים הנדרשים אשכולות DNA במהלך NGS, השוללים את דרישת קשירת מתאם נפרדת. בקרת איכות (QC) נערכה על מנת להעריך התפלגות גודל שבר דנ"א ולהתאיםאה DNA התאגדות לפני NGS. קבצי פלט רצף מסוננים עבור LTR המכיל קורא, ואת הרצפים בהגדרת LTR והמקשר נחתכים משם. רצפים התא המארח גזוז ממופים הגנום התייחסות באמצעות בלאט ו מסוננים עבור זהות מינימלית 97% עד לנקודה ייחודית בגנום התייחסות. אתרי אינטגרציה ייחודיים בחן עבור נוקלאוטיד הסמוך (NT) ביחס רצף והפצה לתכונות גנומי שונות. שימוש בפרוטוקול זה, ספריות באתר אינטגרציה גבוהות של מורכבות ניתן לבנות הדנ"א הגנומי בשלושה ימים. הפרוטוקול כולו שמקיף זיהום ויראלי אקסוגני של תאים בתרבית רקמה ניתן לאנליזה האתר אינטגרציה ולכן יכול להתנהל כ שבוע עד שבועיים. היישומים אחרונים של טכנולוגיה זו נוגעים ניתוח אורך של אתרי אינטגרציה מחולים עם HIV.

Introduction

שילוב של ה- DNA הנגיפי (vDNA) לתוך הגנום של התא הפונדקאי הוא צעד חיוני במחזור חי retroviral. אינטגרציה מושגת על ידי integrase אנזים ויראלי (IN), אשר מבצע שני תהליכים קטליטיים ברורים שיובילו להקמת provirus מוכנס ביציבות 1. לפי יחידות משנה להעסיק את הקצוות של vDNA ליניארי כי נוצר באמצעות שעתוק לאחור, להרכיב את intasome מהסדר הגבוה עם vDNA מסתיים מחוזקת ביחד בידי לפי multimer 2-4. לפי וחותך את 'הקצוות של vDNA במורד הזרם 5'-CA-3 משתנה' 3 רצפים תהליך המכונה 3'-עיבוד, בהותירה את הפסקה 3 'מסתיים עם קבוצות הידרוקסיל תגובתי בכל vDNA הסופית 5-8. Intasome מיובא לאחר מכן לתוך הגרעין במסגרת אסיפה גדולה של מארח חלבונים נגיפיים הידועים כמתחם preintegration (PIC) 9-11. לאחר המפגש עם המטרה תאית DNA (tDNA), לפי משתמשת vDNA 3'-הידרוקסיל Groעליות לדבוק העליון tDNA וקצובות תחתונות בצורה מדורגת ובמקביל מצטרף vDNA לקבוצות פוספט 'tDNA 5 בתהליך של גדיל העברה 12,13.

העדפות אינטגרציה באתר התערוכה Retroviruses על המאזניים המקומיים והעולמיים. מקומית, אתרי אינטגרצית קונסנסוס מורכבים רצפי tDNA palindromic נשמרים בחולשה כי ההיקף בערך מחמישה עשר נ"ב במורד זרם מאתרי כניסת vDNA 14,15. גלובלי, רטרווירוסים למקד הסברים ספציפיים הכרומטין 16. ישנם שבעה סוגים retroviral שונים – אלפא באמצעות אפסילון, lenti, ו spuma. Lentiviruses, הכולל HIV-1, לטובת השתלבות גופות הגנים לרנ"א 17, בעוד gammaretroviruses לשלב מועדף למתחמי תחילת תעתיק (TSSs) ואזורים משפרים פעילים 18-20. בניגוד חד, spumavirus מוטה חזק כלפי heterochromאזורי atic, כגון 21 תחומי גן-עני הקשורים-lamina. העדפות בסיס tDNA מקומיות הם חלק גדול מוכתב על ידי רשתות ספציפיות של אנשי קשר nucleoprotein שבין פנימי tDNA 13,22,23. עבור lentiviruses ו gammaretroviruses, ביחס אינטגרציה ל- ביאורים הגנומי הוא במידה רבה מוסדר על ידי אינטראקציות בין לפי וגורמים הסלולר מאותו מקור 24-27. שינוי הפרטים של רשת אינטראקציה IN-tDNA 13,22,23,28 ושיבוש או Re-engineering IN-מארח אינטראקציות גורם 25-27,29-32 מוכחות אסטרטגיות כדי להתמקד מחדש אינטגרציה במישור המקומי והעולמי, בהתאמה.

כוחה של נהלי רצפי DNA היה מקטלגי אתרי אינטגרצית retroviral בכדור הארץ גבר מאוד בעשורים האחרונים. אתרי אינטגרציה שנמצאו בעבודתו החלוצית באמצעות טיהור מייגעת וטכניקות שיבוט ידניות להניב רק קומץ של אתרים ייחודיים לכל 33,34 מחקר.השילוב של הגברת LM-PCR של צמתי DNA LTR-מארח עם היכולת למפות אתרי אינטגרצית פרט הגנום אנושי ועכבר טיוטה הפך את השדה, עם מספר האתרים התאוששו מזיהומי תרבית תאי אקסוגניים רקמות הגדיל לכמה מאה לאלפי 17 , 18. השילוב עדכנית יותר של LM-PCR עם מתודולוגיה NGS שלח נסיקת עומק הספרייה. באופן ספציפי, pyrosequencing הניב בסדר גודל של עשרות אלפי אתרים שילוב ייחודי 30,35-38, בעוד ספריות רצף באמצעות אשכולות DNA יכול להניב מיליוני רצפים ייחודיים 19-21,39. כאן אנו מתארים פרוטוקול LM-PCR אופטימיזציה עבור הגברה וסדר אתרי אינטגרציה retroviral באמצעות NGS אשכולות DNA. השיטה משלבת נדרשת רצפי מתאם לתוך פריימרים PCR ומכאן ישירות לתוך מולקולות דנ"א המוגברות, ובכך מניעת דרישת צעד קשירת מתאם נוסף לפני sequencing 40. צינור ניתוח bioinformatic, מן הניתוח של נתוני רצף גלם צומת DNA LTR-לארח את המיפוי של אתרי אינטגרציה ייחודיים רלוונטי תכונות גנומית, גם מתואר בדרך כלל. בהתאם עדיפות הוקמה מתוך פרוטוקולים מתודולוגיים לפני בתחום זה 36,38,41-43, סקריפטים מותאמים אישית ניתן לפתח על מנת לסייע בהשלמת צעדים ספציפיים בצנרת ביואינפורמטיקה. השירות והרגיש של הפרוטוקול מודגם עם נתונים נציג ידי הגברה, רצף, ומיפוי אתרי אינטגרציה HIV-1 מתאי בתרבית רקמה הנגוע על הריבוי המשוער של זיהום (משרד פנים) של 1.0, כמו גם סדרת טיטרציה של DNA זה מדולל באמצעות הדנ"א תאי נגוע ב 5-לקפל צעדים לדילול מקסימלית של 1: 15,625 להניב משרד הפנים המקבילים המשוער של 6.4 x 10 -5.

Protocol

1. צור מניות וירוס הערה: תרשים זרימה של היבט הספסל הרטוב של פרוטוקול זה מתואר באיור 1 הפרטים של ייצור מניית ויראלי והזיהום הבא של תאים בתרבית הרקמה יחולו בדרך כלל סוגים שונים של רטרווירוסים.. בניסויים מסוימים, תא המטרה לא יכ…

Representative Results

רשימות לוח 4 תוצאות ניסוי נציג כדי להמחיש את הרגישות של NGS לשחזור אתרי אינטגרציה מתרבה של תאים נגועים. DNA התאי הנגוע נוצל כדי לדלל הדנ"א הגנומי סדר מזיהום שבו כל תא בממוצע הכיל שילוב אחד 40. דילולים נערכו שלבים של חמש עד דילול מקסימאלי …

Discussion

פרוטוקול לניתוח אתרי אינטגרציה retroviral, משלב הזיהום בנגיף הראשוני ועד מיפוי של דפוסי תפוצה גנומית, מתואר. פרוטוקול זה חל על כל רטרו-וירוס וכל סוג תא infectable. יתר על כן, צינור assay רגישה למדי, עם פוטנציאל להתאושש מספר משביע רצון של אתרי שילוב ייחודי בין דילולים סדרתי של שווה ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים עמיתינו סטיבן יוז והנרי לוין לייעוץ היה קריטי להקים פרוטוקול NGS עבור סידור האתר אינטגרציה retroviral במעבדה אנגלמן. עבודה זו נתמכה על ידי ארצות הברית המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AI039394 ו AI052014 (כדי Ane) ו AI060354 (מרכז אוניברסיטת הרווארד לחקר האיידס).

Materials

DMEM Gibco 11965-084 Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH 30088.03 Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production
Penicillin/Streptomycin Corning 30-002-Cl Antibiotics to be added to DMEM
Phosphate-buffered saline Mediatech 21-040-CV Used to wash cells
Trypsin EDTA Corning 25-053-CI Used to detach adherent cells from tissue culture plates
PolyJet SignaGen Laboratories SL100688 DNA transfection reagent
0.45 µm Filters Thermo Scientific 09-740-35B Used to filter virus particle-containing cell culture media
Turbo DNase Ambion AM2239 Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay ABL Inc. 5447 Used to quantify yield of virus production
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506 Used to purify genomic DNA from cells
Sonicator Covaris S2 With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec
Nuclease-Free Water GeneMate G-3250-125 Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Used to purify DNA during library construction
End-It DNA End-Repair Kit Epicentre ER81050 Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples
Klenow Fragment (3'-5' exo–) New England Biolabs (NEB) M0212S Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments
dATP Thermo Scientific R0141 Deoxyadenosine triphosphate
MseI NEB R0525L Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage
BglII NEB R0144L Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence
T4 DNA Ligase NEB M0202L/6218 Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends
DNA Oligonucleotides Integrated DNA Technologies custom Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs 
Advantage 2 Polymerase Mix Clontech 639202 Commercial mix containing DNA polymerase for PCR
dNTPs (100 mM solutions) Thermo Scientific R0181 Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP
NanoDrop Thermo Scientific NanoDrop 2000 Spectrophotometer for determination of DNA concentration
Qubit Fluorimeter Life Technologies Qubit® 3.0 Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration
2200 TapeStation System Agilent G2964AA Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution
MiSeq Illumina SY-410-1003 Used for NGS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890 (2012).
  2. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
  3. Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464, 232-236 (2010).
  4. Hare, S., Maertens, G. N., Cherepanov, P. 3′-processing and strand transfer catalysed by retroviral integrase in crystallo. EMBO J. 31, 3020-3028 (2012).
  5. Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54, 497-504 (1988).
  6. Roth, M. J., Schwartzberg, P. L., Goff, S. P. Structure of the termini of DNA intermediates in the integration of retroviral DNA: dependence on IN function and terminal DNA sequence. Cell. 58, 47-54 (1989).
  7. Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Retroviral integration: structure of the initial covalent product and its precursor, and a role for the viral IN protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 2525-2529 (1989).
  8. Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179, 886-889 (1990).
  9. Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3, 469-478 (1989).
  10. Bukrinsky, M. I., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 6580-6584 (1992).
  11. Miller, M. D., Farnet, C. M., Bushman, F. D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71, 5382-5390 (1997).
  12. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67, 1211-1221 (1991).
  13. Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468, 326-329 (2010).
  14. Holman, A. G., Coffin, J. M. Symmetrical base preferences surrounding HIV-1, avian sarcoma/leukosis virus, and murine leukemia virus integration sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 6103-6107 (2005).
  15. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M., Munroe, D. J. Weak palindromic consensus sequences are a common feature found at the integration target sites of many retroviruses. J. Virol. 79, 5211-5214 (2005).
  16. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42, 10209-10225 (2014).
  17. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  18. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
  19. LaFave, M. C., et al. MLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42, 4257-4269 (2014).
  20. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J. Virol. 88, 4504-4513 (2014).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523, 366-369 (2015).
  22. Serrao, E., et al. Integrase residues that determine nucleotide preferences at sites of HIV-1 integration: implications for the mechanism of target DNA binding. Nucleic Acids Res. 42, 5164-5176 (2014).
  23. Aiyer, S., et al. Structural and sequencing analysis of local target DNA recognition by MLV integrase. Nucleic Acids Res. 43, 5647-5663 (2015).
  24. Ciuffi, A., et al. A role for LEDGF/p75 in targeting HIV DNA integration. Nat. Med. 11, 1287-1289 (2005).
  25. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 12036-12041 (2013).
  26. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J. Virol. 87, 12721-12736 (2013).
  27. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell Rep. 5, 886-894 (2013).
  28. Demeulemeester, J., et al. HIV-1 integrase variants retarget viral integration and are associated with disease progression in a chronic infection cohort. Cell Host Microbe. 16, 651-662 (2014).
  29. Meehan, A. M., et al. LEDGF/p75 proteins with alternative chromatin tethers are functional HIV-1 cofactors. PLoS Pathog. 5, e1000522 (2009).
  30. Ferris, A. L., et al. Lens epithelium-derived growth factor fusion proteins redirect HIV-1 DNA integration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 3135-3140 (2010).
  31. Gijsbers, R., et al. LEDGF hybrids efficiently retarget lentiviral integration into heterochromatin. Mol. Ther. 18, 552-560 (2010).
  32. Aiyer, S., et al. Altering murine leukemia virus integration through disruption of the integrase and BET protein family interaction. Nucleic Acids Res. 42, 5917-5928 (2014).
  33. Jahner, D., Jaenisch, R. Integration of Moloney leukaemia virus into the germ line of mice: correlation between site of integration and virus activation. Nature. 287, 456-458 (1980).
  34. Stevens, S. W., Griffith, J. D. Human immunodeficiency virus type 1 may preferentially integrate into chromatin occupied by L1Hs repetitive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 5557-5561 (1994).
  35. Wang, G. P., Ciuffi, A., Leipzig, J., Berry, C. C., Bushman, F. D. HIV integration site selection: analysis by massively parallel pyrosequencing reveals association with epigenetic modifications. Genome Res. 17, 1186-1194 (2007).
  36. Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic Acids Res. 36, e49 (2008).
  37. Roth, S. L., Malani, N., Bushman, F. D. Gammaretroviral integration into nucleosomal target DNA in vivo. J. Virol. 85, 7393-7401 (2011).
  38. Ciuffi, A., Barr, S. D. Identification of HIV integration sites in infected host genomic DNA. Methods. 53, 39-46 (2011).
  39. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117, 3113-3122 (2011).
  40. Matreyek, K. A., et al. Host and viral determinants for MxB restriction of HIV-1 infection. Retrovirology. 11, 90 (2014).
  41. Ciuffi, A., et al. Methods for integration site distribution analyses in animal cell genomes. Methods. 47, 261-268 (2009).
  42. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39, e72 (2011).
  43. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol. Biol. 1185, 321-344 (2014).
  44. Page, K. A., Landau, N. R., Littman, D. R. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64, 5270-5276 (1990).
  45. Emi, N., Friedmann, T., Yee, J. K. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J. Virol. 65, 1202-1207 (1991).
  46. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
  47. Goff, S., Traktman, P., Baltimore, D. Isolation and properties of Moloney murine leukemia virus mutants: use of a rapid assay for release of virion reverse transcriptase. J. Virol. 38, 239-248 (1981).
  48. Willey, R. L., et al. In vitro mutagenesis identifies a region within the envelope gene of the human immunodeficiency virus that is critical for infectivity. J. Virol. 62, 139-147 (1988).
  49. Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nat. Med. 7, 631-634 (2001).
  50. Brussel, A., Sonigo, P. Analysis of early human immunodeficiency virus type 1 DNA synthesis by use of a new sensitive assay for quantifying integrated provirus. J. Virol. 77, 10119-10124 (2003).
  51. Serrao, E., Ballandras-Colas, A., Cherepanov, P., Maertens, G. N., Engelman, A. N. Key determinants of target DNA recognition by retroviral intasomes. Retrovirology. 12, 39 (2015).
  52. Maldarelli, F., et al. HIV latency. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345, 179-183 (2014).
  53. Wagner, T. A., et al. HIV latency. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345, 570-573 (2014).
  54. Cohn, L. B., et al. HIV-1 integration landscape during latent and active infection. Cell. 160, 420-432 (2015).
  55. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the QubitTM RNA HS assay using RNA spike-in. BMC Mol. Biol. 16, 9 (2015).
  56. Padmanaban, A., Walker, D. M. . Analysis of high molecular weight genomic DNA using the Agilent 2200 TapeStation and genomic DNA ScreenTape. Publication number 5991-1797EN Agilent Technologies. , (2013).
  57. . . Kapa library quantification technical guide version v1.14. , (2014).
  58. Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 12, 656-664 (2002).
  59. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  60. Gaur, M., Leavitt, A. D. Mutations in the human immunodeficiency virus type 1 integrase D,D(35)E motif do not eliminate provirus formation. J. Virol. 72, 4678-4685 (1998).
  61. Varadarajan, J., McWilliams, M. J., Hughes, S. H. Treatment with suboptimal doses of raltegravir leads to aberrant HIV-1 integrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 14747-14752 (2013).
  62. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12, 996-1006 (2002).
  63. Berry, C. C., et al. Estimating abundances of retroviral insertion sites from DNA fragment length data. Bioinformatics. 28, 755-762 (2012).
  64. Firouzi, S., et al. Development and validation of a new high-throughput method to investigate the clonality of HTLV-1-infected cells based on provirus integration sites. Genomic Med. 6, 46 (2014).
  65. Mitchell, R. S., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2, E234 (2004).
  66. Schneider, T. D., Stormo, G. D., Gold, L., Ehrenfeucht, A. Information content of binding sites on nucleotide sequences. J. Mol. Biol. 188, 415-431 (1986).
  67. Langmead, B. Chapter 11, Unit 11. 17, Aligning sort sequencing reads with Bowtie. Curr. Protoc. Bioinformatics. , (2010).
  68. LaFave, M. C., Varshney, G. K., Burgess, S. M. GeIST: a pipeline for mapping integrated DNA elements. Bioinformatics. 31, 3219-3221 (2015).
  69. Hocum, J. D., et al. VISA – Vector Integration Site Analysis server: a web-based server to rapidly identify retroviral integration sites from next-generation sequencing. BMC Bioinformatics. 16, 212 (2015).
  70. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15, 1431-1436 (2009).
  71. . . TruSeq Library Prep Pooling Guide. Guidelines for pooling TruSeq libraries for Illumina sequencing systems that require balanced index combinations. , (2015).

Tags

Keywords: AmplificationNext-generation SequencingGenomic DNA MappingRetroviral Integration SitesPCRDNA SequencingHEK293T CellsTransfectionVirus ConcentrationP24 AntigenCell Infection
check_url/53840?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Serrao, E., Cherepanov, P., Engelman, A. N. Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites. J. Vis. Exp. (109), e53840, doi:10.3791/53840 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image