JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Published: March 22, 2016
doi:
10.3791/53840
, ,
1Department of Cancer Immunology and AIDS,Dana-Farber Cancer Institute, 2Chromatin Structure and Mobile DNA,The Francis Crick Institute

Summary

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Abstract

Retrovirussen vertonen handtekening integratie voorkeuren op zowel de lokale en wereldwijde schaal. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor (1) genereren van diverse bibliotheken van retrovirale integratieplaatsen middels ligatie-gemedieerde PCR (LM-PCR) amplificatie en de volgende generatie sequencing (NGS), (2) kaart brengen van de genomische locatie van elk virus gastheer junction behulp BEDTools, en (3) het analyseren van de gegevens voor statistische relevantie. Genomisch DNA geëxtraheerd uit geïnfecteerde cellen is gefragmenteerd door digestie met restrictie-enzymen of door sonicatie. Na geschikte DNA end-reparatie, zijn double-stranded linkers geligeerd op de DNA-uiteinden en semi-nested PCR wordt uitgevoerd met primers die complementair zijn aan zowel de lange terminale herhaling (LTR) uiteinde van het virus en de geligeerde linker DNA. De PCR primers dragen sequenties die vereist zijn voor DNA-clustering in NGS, teniet de behoefte aan apart adapter ligatie. Kwaliteitscontrole (QC) is uitgevoerd om DNA-fragment grootteverdeling evalueren en aanpassener DNA opname voorafgaand aan de NGS. Sequence output bestanden worden gefilterd voor LTR-bevattende leest, en de sequenties definiëren van de LTR en de linker zijn weg afgesneden. Bijgesneden gastheercel sequenties worden toegewezen aan een referentie genoom behulp BLAT en gefilterd voor minimaal 97% identiteit met een unieke plaats in de referentie genoom. Unieke integratieplaatsen worden onderzocht voor aangrenzende nucleotide (nt) sequentie en distributie ten opzichte van verschillende genomische functies. Met dit protocol, kan integratieplaats bibliotheken met hoge complexiteit worden geconstrueerd uit genomisch DNA in drie dagen. De gehele protocol dat exogene virale infectie van gevoelige weefselkweek cellen integratieplaats analyse omvat kan derhalve worden uitgevoerd bij ongeveer 1-2 weken. Recente toepassingen van deze technologie hebben betrekking op longitudinale analyse van de integratie sites uit HIV-geïnfecteerde patiënten.

Introduction

Integratie van viraal DNA (vDNA) in het gastheergenoom is een essentiële stap in de virale levenscyclus. Integratie wordt bereikt door het virale enzym integrase (IN), die zich bezighoudt met twee verschillende katalytische processen die leiden tot de oprichting van een stabiel ingebracht provirus 1. IN subeenheden aangrijpen op de uiteinden van de lineaire vDNA dat wordt gegenereerd door middel van reverse transcriptie, die de hogere orde intasome met vDNA uiteinden samengehouden door een IN multimeer 2-4. IN splitst de 3 'einden van het vDNA stroomafwaarts van invariante 5'-CA-3' sequenties in een proces dat 3'-verwerking, het verlaten verzonken 3'-uiteinden met reactieve hydroxylgroepen op elk uiteinde vDNA 5-8. De intasome wordt vervolgens in de kern ingevoerd als deel van een grote verzameling van gastheer en virale proteïnen bekend als de preintegration complex (PIC) 9-11. Na het ontmoeten van cellulaire doelwit DNA (TDNA), IN gebruikt de vDNA 3'-hydroxyl groups om de TDNA boven- en onderkant strengen in een versprongen wijze aanhangen en tegelijkertijd voegt zich bij de vDNA om TDNA 5 'fosfaatgroepen door het proces van het strand transfer 12,13.

Retrovirussen vertonen integratie voorkeuren voor websites op de lokale en wereldwijde schaal. Lokaal, consensus integratie plaatsen bestaan ​​uit zwak geconserveerde palindroom TDNA sequenties die variëren van ongeveer 5-10 bp stroomopwaarts als stroomafwaarts van de vDNA insertieplaatsen 14,15. Wereldwijd retrovirussen richten zich op specifieke chromatine annotaties 16. Er zijn zeven verschillende retrovirale genera – alfa door middel van epsilon, Lenti, en spuma. De lentivirussen, die HIV-1 omvatten, gunst integratie binnen de lichamen van actief getranscribeerd genen 17, terwijl de gammaretrovirussen voorkeur te integreren in de transcriptie start sites (Tsss) en actieve versterker regio's 18-20. In scherp contrast, is spumavirus sterk neigt in de richting heterochromATIC regio's, zoals gen-arme-lamina bijbehorende domeinen 21. Lokale TDNA base voorkeuren zijn voor een groot deel bepaald door de specifieke netwerken van nucleoproteïne contacten tussen IN en TDNA 13,22,23. Voor de lentivirussen en gammaretrovirussen, integratie ten opzichte van genomische annotaties is voor een groot deel bepaald door de interactie tussen IN en verwante cellulaire factoren 24-27. Het veranderen van de specifieke kenmerken van de IN-TDNA interactie netwerk 13,22,23,28 en verstoren of re-engineering IN-host-factor interacties 25-27,29-32 zijn bewezen strategieën om de integratie retarget op lokaal en mondiaal niveau, respectievelijk.

De kracht van DNA sequencing procedures gebruikt aan catalogus retrovirale integratieplaatsen is enorm in de afgelopen decennia. Integratie sites werden teruggevonden in baanbrekende werk met behulp van bewerkelijke zuivering en handmatige kloontechnieken tot slechts een handvol unieke locaties per studie 33,34 opleveren.De combinatie van LM-PCR amplificatie van LTR-gastheer-DNA kruispunten met de mogelijkheid om afzonderlijke integratieplaatsen voor mens en muis ontwerp genomen veranderde het gebied in kaart met het aantal sites gewonnen uit exogene weefselkweek cellen infecties verhogen tot enkele honderden tot duizenden 17 , 18. De meer recente combinatie van LM-PCR met NGS methodologie bibliotheek diepte rijzen de pan uit gestuurd. Specifiek, pyrosequencing leverde in de orde van tienduizenden unieke integratieplaatsen 30,35-38, terwijl bibliotheken gesequentieerd met behulp van DNA clustervorming miljoenen unieke sequenties 19-21,39 verkregen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde LM-PCR-protocol voor het versterken en het sequencen van retrovirale integratie sites met behulp van DNA-clustering NGS. De werkwijze omvat benodigde adapter sequenties in de PCR primers en dus rechtstreeks in de geamplificeerde DNA-moleculen, waardoor de vereiste weg staat tegen adapter ligatie stap vóór sequencing 40. De bio-informatica-analyse pijpleiding van het parseren van ruwe sequentiegegevens voor LTR-gastheer-DNA junctions het in kaart brengen van unieke integratieplaatsen genomisch features relevant, wordt ook algemeen beschreven. Overeenkomstig de vastgestelde stand van methodologische voorschriften dit gebied 36,38,41-43 voorrang, kunnen aangepaste scripts worden ontwikkeld om de voltooiing van de specifieke stappen in de bioinformatica pijplijn helpen. Het nut en de gevoeligheid van het protocol wordt geïllustreerd met representatieve gegevens door amplificatie, sequencing, en afbeelden van HIV-1 integratieplaatsen van weefselkweek cellen geïnfecteerd met de multipliciteit van infectie (MOI) van 1,0, en een titratiereeks van dit DNA verdund met ongeïnfecteerde cellulair DNA in 5-voudige stappen hoogste verdunning van 1: 15.625 tot bij benadering equivalente MOI opbrengst van 6,4 x 10 -5.

Protocol

1. Genereer Virus Stocks Opmerking: Een stroomschema van de wet bench aspect van dit protocol is in Figuur 1 De gegevens van virusvoorraad productie en daaropvolgende infectie van weefselcultuur cellen algemeen voor verschillende retrovirussen.. Voor sommige experimenten, kan de doelcel niet de endogene virale receptor (en) tot expressie, en in dergelijke gevallen de constructie van pseudo-getypeerde retrovirale deeltjes herbergen heterologe virale envelop glycoproteïne, …

Representative Results

Tabel 4 vermeldt de resultaten van een representatief experiment om de gevoeligheid van NGS illustreren voor het terugwinnen integratieplaatsen uit een kweek van geïnfecteerde cellen. Geïnfecteerde cellulaire DNA werd gebruikt om serieel verdunde genomisch DNA van een infectie waarin elke cel gemiddeld staand een integratie 40. Verdunningen werden bereid in stappen van vijf tot een maximale verdunning van 1: 15.625. Genomisch DNA in het titratiereeks Vervolg…

Discussion

Een protocol voor de analyse van retrovirale integratieplaatsen, de initiële virusinfectie stap door de omschrijving van genomische verspreidingspatronen wordt beschreven. Dit protocol is toepasbaar op elk retrovirus geïnfecteerd en elk celtype. Bovendien is de assay pijpleiding is zeer gevoelig, met de potentie om een bevredigend aantal unieke integratieplaatsen van seriële verdunningen van genomisch DNA overeenkomt herstellen tot die van een infectie gestart met een MOI van 6,4 x 10 -5. Deze gevoeligheid…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn dankbaar dat onze collega Stephen Hughes en Henry Levin voor het advies dat van cruciaal belang voor de NGS protocol voor retrovirale integratie ter sequencing te vestigen in de Engelman lab was. Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health subsidies AI039394 en AI052014 (tot ANE) en AI060354 (Harvard University Center for AIDS Research).

Materials

DMEM Gibco 11965-084 Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH 30088.03 Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production
Penicillin/Streptomycin Corning 30-002-Cl Antibiotics to be added to DMEM
Phosphate-buffered saline Mediatech 21-040-CV Used to wash cells
Trypsin EDTA Corning 25-053-CI Used to detach adherent cells from tissue culture plates
PolyJet SignaGen Laboratories SL100688 DNA transfection reagent
0.45 µm Filters Thermo Scientific 09-740-35B Used to filter virus particle-containing cell culture media
Turbo DNase Ambion AM2239 Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay ABL Inc. 5447 Used to quantify yield of virus production
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506 Used to purify genomic DNA from cells
Sonicator Covaris S2 With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec
Nuclease-Free Water GeneMate G-3250-125 Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Used to purify DNA during library construction
End-It DNA End-Repair Kit Epicentre ER81050 Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples
Klenow Fragment (3'-5' exo–) New England Biolabs (NEB) M0212S Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments
dATP Thermo Scientific R0141 Deoxyadenosine triphosphate
MseI NEB R0525L Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage
BglII NEB R0144L Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence
T4 DNA Ligase NEB M0202L/6218 Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends
DNA Oligonucleotides Integrated DNA Technologies custom Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs 
Advantage 2 Polymerase Mix Clontech 639202 Commercial mix containing DNA polymerase for PCR
dNTPs (100 mM solutions) Thermo Scientific R0181 Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP
NanoDrop Thermo Scientific NanoDrop 2000 Spectrophotometer for determination of DNA concentration
Qubit Fluorimeter Life Technologies Qubit® 3.0 Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration
2200 TapeStation System Agilent G2964AA Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution
MiSeq Illumina SY-410-1003 Used for NGS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890 (2012).
  2. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
  3. Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464, 232-236 (2010).
  4. Hare, S., Maertens, G. N., Cherepanov, P. 3′-processing and strand transfer catalysed by retroviral integrase in crystallo. EMBO J. 31, 3020-3028 (2012).
  5. Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54, 497-504 (1988).
  6. Roth, M. J., Schwartzberg, P. L., Goff, S. P. Structure of the termini of DNA intermediates in the integration of retroviral DNA: dependence on IN function and terminal DNA sequence. Cell. 58, 47-54 (1989).
  7. Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Retroviral integration: structure of the initial covalent product and its precursor, and a role for the viral IN protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 2525-2529 (1989).
  8. Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179, 886-889 (1990).
  9. Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3, 469-478 (1989).
  10. Bukrinsky, M. I., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 6580-6584 (1992).
  11. Miller, M. D., Farnet, C. M., Bushman, F. D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71, 5382-5390 (1997).
  12. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67, 1211-1221 (1991).
  13. Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468, 326-329 (2010).
  14. Holman, A. G., Coffin, J. M. Symmetrical base preferences surrounding HIV-1, avian sarcoma/leukosis virus, and murine leukemia virus integration sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 6103-6107 (2005).
  15. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M., Munroe, D. J. Weak palindromic consensus sequences are a common feature found at the integration target sites of many retroviruses. J. Virol. 79, 5211-5214 (2005).
  16. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42, 10209-10225 (2014).
  17. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  18. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
  19. LaFave, M. C., et al. MLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42, 4257-4269 (2014).
  20. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J. Virol. 88, 4504-4513 (2014).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523, 366-369 (2015).
  22. Serrao, E., et al. Integrase residues that determine nucleotide preferences at sites of HIV-1 integration: implications for the mechanism of target DNA binding. Nucleic Acids Res. 42, 5164-5176 (2014).
  23. Aiyer, S., et al. Structural and sequencing analysis of local target DNA recognition by MLV integrase. Nucleic Acids Res. 43, 5647-5663 (2015).
  24. Ciuffi, A., et al. A role for LEDGF/p75 in targeting HIV DNA integration. Nat. Med. 11, 1287-1289 (2005).
  25. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 12036-12041 (2013).
  26. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J. Virol. 87, 12721-12736 (2013).
  27. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell Rep. 5, 886-894 (2013).
  28. Demeulemeester, J., et al. HIV-1 integrase variants retarget viral integration and are associated with disease progression in a chronic infection cohort. Cell Host Microbe. 16, 651-662 (2014).
  29. Meehan, A. M., et al. LEDGF/p75 proteins with alternative chromatin tethers are functional HIV-1 cofactors. PLoS Pathog. 5, e1000522 (2009).
  30. Ferris, A. L., et al. Lens epithelium-derived growth factor fusion proteins redirect HIV-1 DNA integration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 3135-3140 (2010).
  31. Gijsbers, R., et al. LEDGF hybrids efficiently retarget lentiviral integration into heterochromatin. Mol. Ther. 18, 552-560 (2010).
  32. Aiyer, S., et al. Altering murine leukemia virus integration through disruption of the integrase and BET protein family interaction. Nucleic Acids Res. 42, 5917-5928 (2014).
  33. Jahner, D., Jaenisch, R. Integration of Moloney leukaemia virus into the germ line of mice: correlation between site of integration and virus activation. Nature. 287, 456-458 (1980).
  34. Stevens, S. W., Griffith, J. D. Human immunodeficiency virus type 1 may preferentially integrate into chromatin occupied by L1Hs repetitive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 5557-5561 (1994).
  35. Wang, G. P., Ciuffi, A., Leipzig, J., Berry, C. C., Bushman, F. D. HIV integration site selection: analysis by massively parallel pyrosequencing reveals association with epigenetic modifications. Genome Res. 17, 1186-1194 (2007).
  36. Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic Acids Res. 36, e49 (2008).
  37. Roth, S. L., Malani, N., Bushman, F. D. Gammaretroviral integration into nucleosomal target DNA in vivo. J. Virol. 85, 7393-7401 (2011).
  38. Ciuffi, A., Barr, S. D. Identification of HIV integration sites in infected host genomic DNA. Methods. 53, 39-46 (2011).
  39. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117, 3113-3122 (2011).
  40. Matreyek, K. A., et al. Host and viral determinants for MxB restriction of HIV-1 infection. Retrovirology. 11, 90 (2014).
  41. Ciuffi, A., et al. Methods for integration site distribution analyses in animal cell genomes. Methods. 47, 261-268 (2009).
  42. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39, e72 (2011).
  43. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol. Biol. 1185, 321-344 (2014).
  44. Page, K. A., Landau, N. R., Littman, D. R. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64, 5270-5276 (1990).
  45. Emi, N., Friedmann, T., Yee, J. K. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J. Virol. 65, 1202-1207 (1991).
  46. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
  47. Goff, S., Traktman, P., Baltimore, D. Isolation and properties of Moloney murine leukemia virus mutants: use of a rapid assay for release of virion reverse transcriptase. J. Virol. 38, 239-248 (1981).
  48. Willey, R. L., et al. In vitro mutagenesis identifies a region within the envelope gene of the human immunodeficiency virus that is critical for infectivity. J. Virol. 62, 139-147 (1988).
  49. Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nat. Med. 7, 631-634 (2001).
  50. Brussel, A., Sonigo, P. Analysis of early human immunodeficiency virus type 1 DNA synthesis by use of a new sensitive assay for quantifying integrated provirus. J. Virol. 77, 10119-10124 (2003).
  51. Serrao, E., Ballandras-Colas, A., Cherepanov, P., Maertens, G. N., Engelman, A. N. Key determinants of target DNA recognition by retroviral intasomes. Retrovirology. 12, 39 (2015).
  52. Maldarelli, F., et al. HIV latency. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345, 179-183 (2014).
  53. Wagner, T. A., et al. HIV latency. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345, 570-573 (2014).
  54. Cohn, L. B., et al. HIV-1 integration landscape during latent and active infection. Cell. 160, 420-432 (2015).
  55. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the QubitTM RNA HS assay using RNA spike-in. BMC Mol. Biol. 16, 9 (2015).
  56. Padmanaban, A., Walker, D. M. . Analysis of high molecular weight genomic DNA using the Agilent 2200 TapeStation and genomic DNA ScreenTape. Publication number 5991-1797EN Agilent Technologies. , (2013).
  57. . . Kapa library quantification technical guide version v1.14. , (2014).
  58. Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 12, 656-664 (2002).
  59. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  60. Gaur, M., Leavitt, A. D. Mutations in the human immunodeficiency virus type 1 integrase D,D(35)E motif do not eliminate provirus formation. J. Virol. 72, 4678-4685 (1998).
  61. Varadarajan, J., McWilliams, M. J., Hughes, S. H. Treatment with suboptimal doses of raltegravir leads to aberrant HIV-1 integrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 14747-14752 (2013).
  62. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12, 996-1006 (2002).
  63. Berry, C. C., et al. Estimating abundances of retroviral insertion sites from DNA fragment length data. Bioinformatics. 28, 755-762 (2012).
  64. Firouzi, S., et al. Development and validation of a new high-throughput method to investigate the clonality of HTLV-1-infected cells based on provirus integration sites. Genomic Med. 6, 46 (2014).
  65. Mitchell, R. S., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2, E234 (2004).
  66. Schneider, T. D., Stormo, G. D., Gold, L., Ehrenfeucht, A. Information content of binding sites on nucleotide sequences. J. Mol. Biol. 188, 415-431 (1986).
  67. Langmead, B. Chapter 11, Unit 11. 17, Aligning sort sequencing reads with Bowtie. Curr. Protoc. Bioinformatics. , (2010).
  68. LaFave, M. C., Varshney, G. K., Burgess, S. M. GeIST: a pipeline for mapping integrated DNA elements. Bioinformatics. 31, 3219-3221 (2015).
  69. Hocum, J. D., et al. VISA – Vector Integration Site Analysis server: a web-based server to rapidly identify retroviral integration sites from next-generation sequencing. BMC Bioinformatics. 16, 212 (2015).
  70. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15, 1431-1436 (2009).
  71. . . TruSeq Library Prep Pooling Guide. Guidelines for pooling TruSeq libraries for Illumina sequencing systems that require balanced index combinations. , (2015).

Tags

Keywords: AmplificationNext-generation SequencingGenomic DNA MappingRetroviral Integration SitesPCRDNA SequencingHEK293T CellsTransfectionVirus ConcentrationP24 AntigenCell Infection
check_url/53840?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Serrao, E., Cherepanov, P., Engelman, A. N. Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites. J. Vis. Exp. (109), e53840, doi:10.3791/53840 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image