레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑
Summary
We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.
Abstract
모두 로컬 및 글로벌 규모에 레트로 바이러스 전시 서명 통합 환경 설정. 여기서는 결찰 매개 PCR (LM-PCR) 증폭 및 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용하여 레트로 바이러스 통합 위치의 다양한 라이브러리 (1)의 생성에 대한 상세한 프로토콜, (2) 각각의 바이러스에의 게놈 위치에 맵핑을 제시 BEDTools 접합을 이용하고, (3)에 대한 통계 관련 데이터를 분석하는 호스트. 감염된 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 제한 효소에 의해 또는 초음파 분해에 의해 분열된다. 적합한 DNA 최종 복구 한 후, 이중 가닥의 링커는 DNA 종료에 라이 게이션하고, 반 중첩 PCR은 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR) 단부와 결찰 링커 DNA 모두에 상보적인 프라이머를 사용하여 수행된다. 상기 증폭 된 PCR 프라이머는 별도의 어댑터 결찰에 대한 요구 사항을 부정, NGS 동안 DNA 클러스터링에 필요한 시퀀스를 수행한다. 품질 관리 (QC)의 DNA 단편 크기 분포를 평가하고 적응 수행NGS 이전에 DNA의 결합을 어. 시퀀스 출력 파일 LTR 함유 판독 필터링되고 LTR 링커 정의 서열 얻어 자른된다. 트림 숙주 세포 서열은 BLAT를 사용하여 참조 게놈 맵핑하고 참조 게놈의 독특한 지점에 최소 97 % 동일성 필터링된다. 고유 한 통합 사이트는 다양한 게놈 기능에 인접한 염기 (NT) 순서 및 유통 기준에 대해 자세히 조사하고 있습니다. 이 프로토콜을 이용하여, 매우 복잡한 통합 사이트 라이브러리 사흘 게놈 DNA로부터 구성 될 수있다. 통합 사이트 분석에 민감한 조직 배양 세포의 외인성 바이러스 감염을 포함하여 전체 프로토콜에 따라서 약 1-2 주에 수행 될 수있다. 이 기술의 최근의 애플리케이션은 HIV 감염 환자에서 통합 부위의 길이에 관계 분석.
Introduction
숙주 세포 게놈 내로 바이러스 DNA (vDNA)의 통합은 레트로 바이러스 생활주기에서 필수적인 단계이다. 통합은 안정적으로 삽입 된 프로 바이러스 (1)의 구축을 초래할 두 가지 촉매 공정을 행한다 바이러스 인테그라 제 효소 (IN)에 의해 달성된다. 서브 유닛의 IN 합체 2-4에 의해 함께 고정 단부 vDNA와 고차 intasome 형성 역전사를 통해 생성 된 선형 vDNA의 단부를 결합. 절단 IN 3'- 처리로 알려진 과정에서 서열 3 '하류 불변 5'-CA-3에서의 단부 vDNA'는 '3 오목 떠나는 각 vDNA 5-8 말단에 반응성 히드 록 실기로 종료한다. intasome이어서 호스트의 대형 어셈블리의 일부와 사전 통합 복합체 (PIC) 9-11로 알려진 바이러스 단백질과 핵으로 가져옵니다. 셀룰러 대상 DNA (tDNA)를 발생한 후, IN은 3'- 수산기 촉진제 vDNA를 사용UPS는 지그재그 방식으로 tDNA의 상단과 하단 가닥을 절단하고 동시에 가닥 전송 12, 13의 과정을 통해 tDNA 5 '인산 그룹에 vDNA에 합류한다.
로컬 및 글로벌 규모에 레트로 바이러스 전시 통합 사이트 환경 설정. 로컬, 합의 통합 사이트는 약 다섯 vDNA 삽입 사이트 14, 15에서 상류 BP와 하류 10에서 걸쳐 약하게 보존 팔린 드롬 tDNA 시퀀스로 구성되어 있습니다. 전 세계적으로 레트로 바이러스는 특정 염색질 주석 (16)을 대상으로. 엡실론, 렌티 및 spuma을 통해 알파 – 일곱 가지 레트로 바이러스 장군이있다. gammaretroviruses 우선적으로 전사 시작 사이트 (TSSs) 및 활성 증강 영역 18 ~ 20에 통합하면서 HIV-1을 포함 렌티 바이러스는 적극적으로 전사 유전자 (17)의 신체 내에서 통합을 선호. 대조적으로, spumavirus 강하게 heterochrom으로 바이어스이러한 유전자 가난한 얇은 관련 도메인 (21) 등의 ATIC 지역. 지역 tDNA 기본 환경 설정 IN과 tDNA 13,22,23 사이의 핵 단백질 연락처의 특정 네트워크에 의해 결정 큰 부분에 있습니다. 렌티 바이러스 및 gammaretroviruses를 들어, 게놈 주석에 통합 상대는 IN과 동족 세포 요인 24-27 사이의 상호 작용에 의해 지배 큰 부분이다. 요인의 상호 작용 25-27,29-32 각각 로컬 및 글로벌 수준의 통합을 재 타겟팅 전략을 입증 IN-호스트 인 – tDNA 상호 작용 네트워크 13,22,23,28의 세부 사항을 변경 및 중단하거나 다시 엔지니어링.
레트로 바이러스 통합 사이트 카탈로그 사용한 DNA 시퀀싱 방법의 힘은 지난 수십 년 동안 상당히 증가 하였다. 통합 사이트는 연구 33, 34 당 고유 한 사이트의 단지 소수를 산출하기 힘든 정화 및 수동 복제 기술을 사용하여 선구적인 작업에 복구되었다.천 (17)에 수백로 증가 외인성 조직 배양 세포 감염에서 회복 사이트의 수와 필드 변환 인간 및 마우스 초안 게놈 개별 통합 사이트 매핑하는 기능 LTR 호스트 DNA 접합부 LM-PCR 증폭의 조합 18. NGS 방법과 LM-PCR의 최근 조합 라이브러리 깊이 폭등을 보냈습니다. 라이브러리 고유 시퀀스 19-21,39 수백만 얻을 수 DNA 클러스터링의 사용을 통해 시퀀싱하는 동안 특히 pyrosequencing는 수십 고유 통합 사이트 30,35-38 수천 정도의 수득 하였다. 여기에서 우리는 증폭 DNA 클러스터링 NGS를 사용하여 레트로 바이러스 통합 사이트를 시퀀싱에 최적화 된 LM-PCR 프로토콜을 설명합니다. 상기 방법은 이에 sequen 전에 추가 어댑터에 결찰 공정에 대한 요구를 배제, 증폭 된 DNA 분자에 따라서 직접 PCR 프라이머에 어댑터 서열을 요구하고 통합한다(40)을 향. 생물 정보학 분석 파이프 라인은, 게놈 기능을 관련의 독특한 통합 사이트 매핑 LTR-호스트 DNA 접합에 대한 원시 시퀀싱 데이터의 분석에서, 또한 일반적으로 설명한다. 이 분야에서 종래 방법론 36,38,41-43 프로토콜에서 설정된 우선 순위에 따라서, 사용자는 스크립트 정보학 파이프 라인의 특정 단계의 완료를 돕기 위해 개발 될 수있다. 유틸리티 및 프로토콜의 민감도 감염 대략 다수 1.0 (MOI)뿐만 아니라,이 DNA의 적정 계열에 감염된 조직 배양 세포에서 HIV-1 삽입 부위를 증폭하여 시퀀싱 한 매핑 대표 데이터로 도시되어 6.4 × 10 -5의 대략 동등한 MOI을 얻었다 15625 :에 감염되지 않은 세포의 DNA를 희석 한 최대 희석 단계를 5 배.
Protocol
Representative Results
Discussion
게놈 분포 패턴의 매핑을 통한 바이러스 감염의 초기 단계에서 레트로 바이러스 통합 위치의 분석을위한 프로토콜은 기술되어있다. 이 프로토콜은 레트로 바이러스 감염 가능한 모든 세포 유형에 적용 가능하다. 또한, 상기 분석 파이프 라인은 6.4 × 10 -5의 MOI로 감염 개시의 게놈 DNA에 상당 희석액에서 고유 삽입 부위의 충분한 수를 복구 할 가능성 매우 민감하다. 세포의 작은 분획은 프?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Engelman 실험실에서 레트로 바이러스 통합 사이트 시퀀싱을위한 NGS 프로토콜을 확립하는 것이 중요했다 우리의 동료 스티븐 휴즈와 조언 헨리 레빈에 감사하고 있습니다. 이 작품은 AI039394과 (ANE에) AI052014 및 AI060354 (AIDS 연구를위한 하버드 대학 센터) 건강의 미국 국립 연구소에 의해 부여 지원되었다.
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-084 | Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH 30088.03 | Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | Antibiotics to be added to DMEM |
| Phosphate-buffered saline | Mediatech | 21-040-CV | Used to wash cells |
| Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CI | Used to detach adherent cells from tissue culture plates |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | DNA transfection reagent |
| 0.45 µm Filters | Thermo Scientific | 09-740-35B | Used to filter virus particle-containing cell culture media |
| Turbo DNase | Ambion | AM2239 | Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks |
| HIV-1 p24 Antigen Capture Assay | ABL Inc. | 5447 | Used to quantify yield of virus production |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | Used to purify genomic DNA from cells |
| Sonicator | Covaris | S2 | With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec |
| Nuclease-Free Water | GeneMate | G-3250-125 | Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination |
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Used to purify DNA during library construction |
| End-It DNA End-Repair Kit | Epicentre | ER81050 | Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples |
| Klenow Fragment (3'-5' exo–) | New England Biolabs (NEB) | M0212S | Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments |
| dATP | Thermo Scientific | R0141 | Deoxyadenosine triphosphate |
| MseI | NEB | R0525L | Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage |
| BglII | NEB | R0144L | Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202L/6218 | Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends |
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | custom | Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs |
| Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639202 | Commercial mix containing DNA polymerase for PCR |
| dNTPs (100 mM solutions) | Thermo Scientific | R0181 | Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer for determination of DNA concentration |
| Qubit Fluorimeter | Life Technologies | Qubit® 3.0 | Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration |
| 2200 TapeStation System | Agilent | G2964AA | Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Used for NGS |
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