JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Induktion af Experimental Autoimmune Encephalomyelitis i mus og evaluering af sygdommen-afhængige Fordeling af immunceller i forskellige væv

Published: May 08, 2016
doi:
10.3791/53933
, , , , , ,
1Institute of Clinical Pharmacology,Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology,Fraunhofer IME

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

Multipel sklerose formodes at være en inflammatorisk autoimmun sygdom, som er karakteriseret ved læsion dannelse i centralnervesystemet (CNS) resulterer i kognitiv og motorisk svækkelse. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en nyttig dyremodel af MS, fordi den også er kendetegnet ved læsion dannelse i CNS, motorisk svækkelse og er også drevet af autoimmune og inflammatoriske reaktioner. En af EAE-modeller induceres med et peptid afledt fra myelin oligodendrocyt protein (MOG) 35-55 i mus. EAE-mus udvikler en fremadskridende sygdomsforløb. Dette kursus er opdelt i tre faser: den prækliniske fase (dag 0 – 9), at sygdommen debut (dag 10 – 11) og den akutte fase (dag 12 – 14),. MS og EAE induceres af autoreaktive T-celler, infiltrerer CNS. Disse T-celler udskiller chemokiner og cytokiner, der fører til ansættelse af yderligere immunceller. Derfor immuncellen fordeling i rygmarven dnder de tre sygdomsområder faser blev undersøgt. At fremhæve tidspunkt af sygdommen, hvor aktiveringen / proliferation / akkumulering af T-celler, B-celler og monocytter starter, blev immuncellen fordeling i lymfeknuder, milt og blod også vurderet. Endvidere blev niveauerne af adskillige cytokiner (IL-1p, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) i de tre sygdomstilstande faser bestemmes, at få indsigt i de inflammatoriske processer af sygdommen. Som konklusion, dataene giver et overblik over den funktionelle profil immunceller under EAE patologi.

Introduction

Multipel sklerose (MS) og dets tilsvarende dyremodel, eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), viser autoimmune neuroinflammation ændringer i centralnervesystemet (CNS). Tidlig aktive MS og EAE-læsioner er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​infiltrerede immunceller. Ætiologien af ​​MS er fortsat ukendt, men er almindeligt anset for at involvere ødelæggelse af myelin medieret af autoreaktive T-celler. Disse autoreaktive T-celler udskiller pro-inflammatoriske cytokiner og kemokiner, som tiltrækker andre immunceller såsom B-celler, monocytter og neutrofiler fra cirkulationen. Monocytter differentierer til makrofager. Interferon gamma (IFNy) udskilt af autoreaktive T-celle polariserer makrofagerne til pro-inflammatoriske makrofager. De proinflammatoriske cytokiner makrofager frigivelse og reaktive oxygenspecies der fremmer apoptose i oligodendrocytter. Død af oligodendrocytter fører til demyelinisering. Endvidere B-celler differentierer til pLasma celler og release autoantistoffer mod myelinskeden, i sidste ende resulterer i nedbrydning af myelin. Tabet af myelin fører til nedbrydning af axoner og neuroner og derved til dannelsen af læsionsområder i CNS som repræsenterer den vigtigste egenskab ved MS 1. I periferien, T-celler og B-celler aktiveret i lymfeknuderne, de prolifererer i milten og migrere gennem omsætning i centralnervesystemet. Monocytter og neutrofiler formere i knoglemarven og også vandrer gennem omsætning i centralnervesystemet.

Leukocyt-ekstravasation fra knoglemarv, milt og lymfeknuder i blodet eller fra blodbanen til CNS er en flertrinsproces, der afhænger af flere faktorer, herunder molekylære vekselvirkninger mellem leukocytter og endotel medieret af kemokiner og kemokinreceptorer. Produktion af kemokiner ved forskellige celletyper kan induceres under immune reaction af cytokiner såsom tumornekrosefaktor-α (TNF), IFNy og interleukin-6 (IL-6), som efterfølgende får immunsystemets celler til stedet for inflammation 2,3. Immunceller præsentere en delmængde af kemokinreceptorer på deres overflade, afhængig af celletype og migration pathway til det inflammatoriske sted. Således CXCR2, CCR1 og CXCR1 udtrykkes på modne neutrofiler i knoglemarv og blod 4, og binding af dens ligander, CXCL2, CCL5 eller CXCL6 henholdsvis aktiverer neutrofiler og fremmer deres adhæsion til endotelet og efterfølgende migrering af cellerne i væv 5-9. CCL2 og CCL20 tiltrække monocytter og Th1 / Th17 celler 10, som udtrykker CCR2 11 og CCR6 12, hhv. CCR1 og CCR5, udtrykt ved forskellige celletyper, herunder T-celler, monocytter og makrofager 13, binder CCL3, CCL5 og CCL7 og opreguleres under MS 14. CXCR3 udtrykkes på T-celler og binder CCL9, CCL10 ogCCL11 15.

Én vigtigste strategi i MS behandling er nedbrydningen af ​​immunceller eller forebyggelse af immuncelle infiltration i CNS. Derfor har blokade af specifikke kemokinreceptorer blevet undersøgt i EAE. Antagonisme eller genetisk sletning af CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 eller CXCR2 19 reducerer EAE patologi, mens antagonisme eller genetisk sletning af CCR1 20, gjorde CCR5 20 eller CXCR3 21 ikke reducere patologi. Derfor ekspressionen af ​​specifikke kemokinreceptorer på leukocytter er afgørende for infiltreringen af ​​sidstnævnte i CNS og dikterer forløbet af EAE.

Udtømningen af immunceller er en effektiv behandling mod MS-patienter, fordi infiltrerede immunceller frigive cytokiner, såsom TNFa, IL-6 og IL-1β, hvilket på sin side fremme den inflammatoriske proces eller nedbrydningen af neuroner 22. Endvidere auto-reaktive Th1-celler frigiver IFNy, som igen stimulerer makrofager til at frigive TNFa, IL-1β og IL-23.

Dette håndskrift beskriver induktionen af ​​EAE, bestemmelse af immun celle fordeling og cytokinniveauer (mRNA) i forskellige væv i EAE-mus. Celler blev isoleret på forskellige tidspunkter i løbet af sygdomsforløbet at tilvejebringe en tidsafhængig overblik over de inflammatoriske processer, der til sidst fører til læsionsdannelse i CNS.

Protocol

ETIK ERKLÆRING: Vores eksperimentelle procedurer er godkendt af den etiske komité af Regierungspräsidium Darmstadt (Tyskland) og bekræft til nationale og europæiske regler. blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser og reducere antallet af anvendte dyr. 1. EAE Model Induktion af EAE model Brug 10- til 13-uger gamle 129S4 / SvJae × C57BL / 6-mus til induktion af EAE. Giv musene en subkutan injektion i den øvre og nedre ryg på den encephalitogene MOG …

Representative Results

Figur 1 giver en skematisk oversigt over de forskellige metoder, der er beskrevet i denne artikel. 1) Mus modtager en injektion af MOG 35-55 antigen og udvikle indledende kliniske symptomer efter 10,7 ± 0,3 dage 28. Et repræsentativt sygdomsforløb af EAE mus er vist i figur 1. 2) Forskellige væv (milt, lymfeknuder, lumbale rygmarv) og blod er udvundet af kontrol- og EAE mus på forskellige tidsp…

Discussion

EAE-modellen beskrevet her har fået mest opmærksomhed som en model for MS og anvendes rutinemæssigt at teste terapeutiske strategier til MS 32. Musen sygdom udviser mange kliniske og histologiske træk ved MS og skyldes induktion af autoimmunitet til neuronale antigener. Sensibiliseringen til myelinantigener er associeret med blod-hjerne-barriere-dysfunktion og derved, immuncelle infiltration i CNS. Vores resultater viser, at immunceller stige forbigående i lymfeknuderne i den akutte fase. Milt-T-celler o…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409 (2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187 (2014).
  13. Katschke, K. J., et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136 (2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. ‘t Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler’s murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

Tags

Keywords: Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE)Multiple SclerosisDemyelinationImmune Cell InfiltrationMiceMyelin Oligodendrocyte GlycoproteinComplete Freund’s AdjuvantPertussis ToxinLymph NodeSpinal CordClinical Symptoms
check_url/53933?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, J., de Bruin, N., Parnham, M. J., Geisslinger, G., Schiffmann, S. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J. Vis. Exp. (111), e53933, doi:10.3791/53933 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image