La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos
Summary
This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.
Abstract
La esclerosis múltiple se presume que es una enfermedad autoinmune inflamatoria, que se caracteriza por la formación de lesiones en el sistema nervioso central (CNS) que resulta en el deterioro cognitivo y motor. la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal útil de la EM, debido a que también se caracteriza por la formación de lesiones en el SNC, el deterioro motor y también es impulsado por reacciones autoinmunes e inflamatorias. Uno de los modelos de EAE se induce con un péptido derivado de la proteína de mielina de oligodendrocitos (MOG) 35 a 55 en ratones. Los ratones con EAE desarrollar un curso de la enfermedad progresiva. Este curso se divide en tres fases: la fase preclínica (día 0 – 9), la aparición de la enfermedad (día 10 – 11) y la fase aguda (día 12 – 14). MS y EAE son inducidas por las células T autorreactivas que se infiltran en el SNC. Estas células T secretan citocinas y quimiocinas que conducen al reclutamiento de más células inmunes. Por lo tanto, la distribución de células inmunes en la médula espinal durante las tres fases de la enfermedad fue investigada. Para poner de relieve el punto de la enfermedad a la que empieza la activación / proliferación / acumulación de células T, células B y monocitos tiempo, se evaluó también la distribución de células inmunes en los nódulos linfáticos, el bazo y la sangre. Además, se determinaron los niveles de varias citoquinas (IL-1, IL-6, IL-23, TNF, IFN) en las tres fases de la enfermedad, para profundizar en los procesos inflamatorios de la enfermedad. En conclusión, los datos proporcionan una visión general del perfil funcional de células inmunes durante la patología EAE.
Introduction
La esclerosis múltiple (MS) y su modelo animal correspondiente, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), muestran cambios de neuroinflamación autoinmunes en el sistema nervioso central (SNC). Early lesiones de la EM y la EAE activos se caracterizan por la presencia de células inmunes infiltradas. La etiología de la EM se desconoce, pero se considera ampliamente implicar la destrucción de la mielina mediada por las células T autorreactivas. Estas células T autorreactivas secretan citoquinas pro-inflamatorias y quimiocinas que atraen otras células inmunes tales como células B, monocitos y neutrófilos de la circulación. Los monocitos se diferencian en macrófagos. El interferón gamma (IFN) secretado por las células T autorreactivas polariza los macrófagos en los macrófagos pro-inflamatorios. Las citoquinas pro-inflamatorias de liberación de los macrófagos y las especies reactivas de oxígeno que promueven la apoptosis en oligodendrocitos. La muerte de los oligodendrocitos conduce a la desmielinización. Además, las células B se diferencian en pLasma células y autoanticuerpos contra la liberación de la vaina de mielina, en última instancia resulta en la degradación de la mielina. La pérdida de la mielina conduce a la degradación de los axones y las neuronas y por lo tanto a la formación de sitios de lesión en el SNC cuales representan la principal característica de 1 MS. En la periferia, las células T y células B se activan en los ganglios linfáticos, que proliferan en el bazo y migran a través de la circulación en el sistema nervioso central. Los monocitos y neutrófilos proliferan en la médula ósea y también migran a través de la circulación en el sistema nervioso central.
La extravasación de leucocitos desde la médula ósea, el bazo y los ganglios linfáticos en la sangre o de la circulación sanguínea en el SNC es un proceso de múltiples etapas que depende de varios factores, incluyendo las interacciones moleculares entre leucocitos y endotelio mediadas por quimiocinas y receptores de quimiocinas. La producción de quimiocinas por diversos tipos de células puede ser inducida durante la Reactio inmunen por citoquinas como factor de necrosis tumoral-α (TNF), IFN y la interleucina-6 (IL-6), que posteriormente se recluta células inmunitarias al sitio de la inflamación 2,3. Las células inmunes presentan un subconjunto de receptores de quimioquinas en su superficie, dependiendo del tipo celular y vía de migración al sitio de la inflamación. Por lo tanto, CXCR2, CCR1 y CXCR1 se expresan en los neutrófilos maduros de la médula ósea y la sangre 4, y la unión de sus ligandos, CXCL2, CCL5 o CXCL6, respectivamente, activa neutrófilos y promueve su adherencia al endotelio y, posteriormente, la migración de las células en los tejidos 5-9. CCL2 y CCL20 atraen monocitos y células Th1 / Th17 10, que expresan CCR2 11 y CCR6 12, respectivamente. CCR1 y CCR5, expresada por diferentes tipos de células, incluyendo las células T, monocitos y macrófagos 13, se unen CCL3, CCL5 y CCL7 y se upregulated durante MS 14. CXCR3 se expresa en las células T y se une CCL9, CCL10 yCCL11 15.
Una estrategia principal en el tratamiento de MS es el agotamiento de las células inmunes o la prevención de la infiltración de células inmunes en el SNC. Por lo tanto, el bloqueo de los receptores de quimiocinas específicos ha sido investigado en EAE. El antagonismo o la eliminación genética de CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 o CXCR2 19 reduce la patología EAE, mientras que el antagonismo o la eliminación genética de CCR1 20, CCR5 20 o CXCR3 21 no redujo la patología. Por lo tanto, la expresión de receptores específicos de quimioquinas en leucocitos es crucial para la infiltración de este último en el SNC y dicta el curso de la EAE.
El agotamiento de las células inmunes es una estrategia de tratamiento eficaz para los pacientes con EM, porque las células inmunes infiltradas liberan citoquinas, tales como TNF, IL-6 y IL-1β, que, a su vez, promueve el proceso inflamatorio o la degradación de las neuronas 22. Además, auto-Las células Th1 reactivas liberan IFN, que a su vez estimula los macrófagos para liberar TNF, IL-1β y IL-23.
Este manuscrito describe la inducción de la EAE, la determinación de la distribución de las células inmunes y los niveles de citoquinas (ARNm) en diversos tejidos en ratones EAE. Las células se aislaron en diferentes momentos durante el curso de la enfermedad para proporcionar una visión general dependiente del tiempo de los procesos inflamatorios que finalmente conducen a la formación de lesiones en el SNC.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de EAE aquí descrito ha recibido la mayor atención como un modelo de MS y se usa rutinariamente en el ensayo de estrategias terapéuticas para MS 32. La enfermedad de ratón exhibe muchas características clínicas e histológicas de MS y es causado por la inducción de la autoinmunidad a los antígenos neuronales. La sensibilización a antígenos de mielina se asocia con disfunción hematoencefálica barrera y por lo tanto, infiltración de células inmunes en el SNC. Nuestros resultados muestran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.
Materials
| ABI Prism 7500 Sequence Detection System | Applied Biosystems, Austin, USA | quantitative PCR system | |
| Accutase | Sigma Aldrich Munich, Germany | A6964 | cell detachment solution |
| CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germany | 562286 | |
| CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germany | 560782 | |
| CD8-eFluor650 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 95-0081-42 | |
| CD11b-eFluor605 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 93-0112-42 | |
| CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germany | 560583 | |
| CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germany | 560143 | |
| CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
| CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | compensation beads |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
| Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
| Cytometer Setup and Tracking beads | BD, Heidelberg, Germany | 642412 | |
| DNase I | Sigma Aldrich Munich, Germany | D5025 | |
| EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
| F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
| First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
| Fc receptor-1 blocking buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| Flow cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
| FlowJo software v10 | Treestar, Ashland, USA | flow cytometry software | |
| LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germany | flow cytometer | |
| Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germany | 560600 | |
| Lysing solution | BD, Heidelberg, Germany | 349202 | |
| Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | fluorescent DNA binding dye |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA extraction kit |
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