Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

Multiple Sklerose ist vermutlich eine entzündliche Autoimmunerkrankung, die durch Bildung von Läsionen im zentralen Nervensystem (ZNS), die sich in kognitiven und motorischen Beeinträchtigungen charakterisiert ist. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein nützliches Tiermodell der MS, weil es auch durch Bildung von Läsionen im ZNS, motorischen Beeinträchtigungen charakterisiert ist und auch von Autoimmun- und Entzündungsreaktionen angetrieben wird. Einer der EAE – Modellen mit einem Peptid , abgeleitet von dem Myelin – Oligodendrozyten – Protein (MOG) _35-55 in Mäusen induziert. Die EAE Mäuse einen progressiven Krankheitsverlauf zu entwickeln. Dieser Kurs ist in drei Phasen unterteilt: die präklinische Phase (Tag 0 – 9), der Ausbruch der Krankheit (Tag 10 – 11) und der akuten Phase (Tag 12 bis 14). MS und EAE werden durch autoreaktive T-Zellen induziert, die das ZNS infiltrieren. Diese T-Zellen sezer Chemokine und Zytokine, die die Einstellung von weiteren Immunzellen führen. Daher ist die Immunzellverteilung im Rückenmark dährend die drei Krankheitsphasen untersucht. Um den Zeitpunkt der Krankheit hervorheben, an dem die Aktivierung / Proliferation / Anhäufung von T-Zellen, B-Zellen und Monozyten beginnt, die Immunzellverteilung in Lymphknoten, Milz und Blut wurde ebenfalls bewertet. Darüber hinaus sind die Ebenen der mehreren Cytokinen (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFN & ggr;) in den drei Krankheitsphasen bestimmt, Einblick in die Entzündungsprozesse der Krankheit zu erhalten. Zusammenfassend liefern die Daten, die einen Überblick über das Funktionsprofil von Immunzellen während EAE Pathologie.

Introduction

Multiple Sklerose (MS) und der entsprechenden Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zeigen, Autoimmun neuroinflammation Veränderungen im zentralen Nervensystem (ZNS). Frühe aktive MS und EAE Läsionen werden durch die Anwesenheit von Immunzellen infiltriert gekennzeichnet. Die Ätiologie von MS ist unbekannt, wird aber häufig von autoreaktiven T-Zellen vermittelt beinhalten die Zerstörung des Myelins betrachtet. Diese autoreaktiver T-Zellen sezernieren pro-inflammatorische Zytokine und Chemokine, die andere Immunzellen anziehen, wie beispielsweise B-Zellen, Monozyten und Neutrophile aus dem Kreislauf. Monozyten differenzieren sich in Makrophagen. Interferon gamma (IFNy) abgesondert von autoreaktiven T-Zelle polarisiert die Makrophagen in pro-inflammatorischen Makrophagen. Die pro-inflammatorischen Makrophagen Freisetzung Zytokine und reaktive Sauerstoffspezies, die Apoptose in Oligodendrozyten fördern. Der Tod der Oligodendrozyten führt zu einer Demyelinisierung. Weiterhin unterscheiden B-Zellen in pLASMA Zellen und Freisetzung Autoantikörper gegen die Myelinscheide, was letztlich zu einer Verschlechterung der Myelin. Der Verlust von Myelin führt zu einer Verschlechterung von Axonen und Nervenzellen und dadurch zur Bildung von Läsionsstellen im ZNS , die das Hauptmerkmal der MS ¹ darstellen. In der Peripherie sind T-Zellen und B-Zellen in den Lymphknoten aktiviert, proliferieren sie in der Milz und wandern durch den Kreislauf in das zentrale Nervensystem. Monocyten und Neutrophile proliferieren im Knochenmark und auch durch den Kreislauf in das zentrale Nervensystem zu migrieren.

Leukozytenextravasation aus dem Knochenmark, der Milz und der Lymphknoten in das Blut oder aus dem Blut in das ZNS ist ein mehrstufiger Prozess, der von mehreren Faktoren abhängt, einschließlich der molekularen Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und von Chemokinen und Chemokinrezeptoren vermittelte Endothel. Die Produktion von Chemokinen durch verschiedene Zelltypen während der Immun reactio induziert werdenn durch Zytokine wie Tumor – Nekrose – Faktor-α (TNF & agr;), IFN & ggr; und Interleukin-6 (IL-6), die anschließend Immunzellen an den Ort der Entzündung ^2,3 rekrutiert. Immunzellen, die eine Untergruppe von Chemokin-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, je nach Zelltyp und Migrationspfad zur Entzündungsstelle. Somit CXCR2, CCR1 und CXCR1 auf reifen Neutrophilen im Knochenmark exprimiert werden und Blut ⁴ und Bindung seiner Liganden, CXCL2, CCL5 oder CXCL6 bzw. aktiviert Neutrophile und fördert ihre Adhäsion an das Endothel und anschließend, um die Migration der Zellen in das Gewebe ^5-9. CCL2 und CCL20 anziehen Monozyten und Th1 / Th17 – Zellen ^10, die jeweils CCR2 ¹¹ und CCR6 ^12, zum Ausdruck bringen. CCR1 und CCR5, die von verschiedenen Zelltypen exprimiert, einschließlich T – Zellen, Monozyten und Makrophagen ¹³ binden CCL3, CCL5 und CCL7 und werden während der MS ¹⁴ aufreguliert. CXCR3 wird ausgedrückt auf T-Zellen und bindet CCL9, CCL10 undCCL11 ^15.

Eine Hauptstrategie in der MS-Behandlung ist der Abbau von Immunzellen oder die Verhinderung von Immunzellinfiltration in das ZNS. Daher hat die Blockade von spezifischen Chemokinrezeptoren wurde in EAE untersucht. Antagonismus oder genetische Deletion von CCR1 ^{16, 17} CCR2, CCR7 ¹⁸ oder CXCR2 ¹⁹ reduziert EAE Pathologie, während Antagonismus oder genetische Deletion von ²⁰ CCR1, CCR5 ²⁰ oder ²¹ CXCR3 hat die Pathologie nicht reduzieren. Daher ist die Expression von spezifischen Chemokinrezeptoren auf Leukozyten entscheidend für die Infiltration des letzteren in das ZNS und bestimmt den Verlauf der EAE.

Die Abreicherung von Immunzellen ist eine wirksame Behandlungsstrategie für MS – Patienten, da infiltriert Immunzellen Cytokine freizusetzen, wie TNFa, IL-6 und IL-1β, welche wiederum, ²² den Entzündungsprozess oder den Abbau von Neuronen fördern. Darüber hinaus auto-reaktiven Th1 Zellen setzen IFNy, die wiederum Makrophagen freizusetzen TNFa, IL-1β und IL-23 stimuliert.

Diese Handschrift beschreibt die Induktion von EAE, die Bestimmung der Immunzellverteilung und die Zytokinkonzentrationen (mRNA) in verschiedenen Geweben in EAE-Mäusen. Die Zellen wurden während des Krankheitsverlaufs zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert eine zeitabhängige Überblick über die entzündlichen Prozesse zu schaffen, die schließlich in der ZNS-Läsion Bildung führen.

Protocol

ETHIK STATEMENT: Unsere experimentellen Verfahren genehmigt werden von der Ethikkommission des Regierungspräsidiums Darmstadt (Deutschland) und den nationalen und europäischen Vorschriften bestätigen. Alle Anstrengungen wurden unternommen, das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der verwendeten Tiere zu verringern. 1. EAE Modell Die Induktion des EAE-Modell Verwenden 10- bis 13-Wochen alten weiblichen 129S4 / SvJae × C57BL / 6-Mäuse zur Induktion von EAE. <…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt eine schematische Übersicht über die verschiedenen Methoden in diesem Artikel beschrieben. 1) Die Mäuse erhalten eine Injektion von MOG 35-55 Antigen und entwickeln erste klinische Symptome nach 10,7 ± 0,3 Tagen 28. Eine repräsentative Krankheitsverlauf der EAE – Mäusen ist in Abbildung 1. 2) verschiedene Gewebe (Milz, Lymphknoten, Lenden – Rückenmark) und Blut werden von de…

Discussion

Die EAE – Modell hier beschrieben hat die meiste Aufmerksamkeit als ein Modell der MS empfangen und in die Prüfung therapeutischer Strategien für MS ³² routinemäßig eingesetzt. Die Maus-Krankheit zeigt viele klinische und histologische Merkmale der MS und wird durch die Induktion von Autoimmunität zu neuronale Antigene verursacht. Die Sensibilisierung gegen Myelin-Antigene ist mit Blut-Hirn-Schranke Dysfunktion assoziiert und dadurch Immunzellinfiltration in das ZNS. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Immunz…

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System	Applied Biosystems, Austin, USA		quantitative PCR system
Accutase	Sigma Aldrich Munich, Germany	A6964	cell detachment solution
CD3-PE-CF594	BD, Heidelberg, Germany	562286
CD4-V500	BD, Heidelberg, Germany	560782
CD8-eFluor650	eBioscience, Frankfurt, Germany	95-0081-42
CD11b-eFluor605	eBioscience, Frankfurt, Germany	93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700	BD, Heidelberg, Germany	560583
CD19-APC-H7	BD, Heidelberg, Germany	560143
CD45-Vioblue	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-910
CompBeads	BD, Heidelberg, Germany	552843	compensation beads
Collagenase A	Sigma Aldrich Munich, Germany	C0130
Cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads	BD, Heidelberg, Germany	642412
DNase I	Sigma Aldrich Munich, Germany	D5025
EAE Kit	Hooke Laboratories, Lawrence, USA	EK2110
F4/80-PE-Cy7	BioLegend, Fell, Germany	123114
First Strand cDNA-Synthesis kit	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K1612
Fc receptor-1 blocking buffer	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
Flow cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	580
FlowJo software v10	Treestar, Ashland, USA		flow cytometry software
LSRII/Fortessa	BD, Heidelberg, Germany		flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7	BD, Heidelberg, Germany	560600
Lysing solution	BD, Heidelberg, Germany	349202
Maxima SYBR Green	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K0221	fluorescent DNA binding dye
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104	RNA extraction kit