Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

A esclerose múltipla é presumido ser uma doença auto-imune inflamatória, que é caracterizada pela formação de lesões no sistema nervoso central (SNC), resultando na deterioração cognitiva e motora. encefalomielite auto-imune experimental (EAE) é um modelo animal útil de EM, uma vez que também é caracterizada pela formação de lesões no sistema nervoso central, perturbações do motor e também é accionado por meio de reacções auto-imunes e inflamatórias. Um dos modelos de EAE é induzida com um péptido derivado da proteína de mielina de oligodendrócitos (MOG) _35-55 em ratos. Os ratos EAE desenvolver um curso doença progressiva. Este curso é dividido em três fases: a fase pré-clínica (dia 0-9), o início da doença (dia 10-11) e a fase aguda (dias 12-14). MS e EAE são induzidas por células T auto-reactivas que se infiltram no SNC. Estas células T segregam citocinas e quimiocinas que conduzem ao recrutamento de outras células do sistema imunológico. Por conseguinte, a distribuição de células imunes na medula espinal durante as três fases da doença foi investigado. Para realçar o ponto de tempo de doença em que a activação / proliferação / acumulação de células T, células B e monócitos é iniciado, a distribuição de células imunes em nódulos linfáticos, baço e sangue foi também avaliada. Além disso, foram determinados os níveis de diversas citocinas (IL-1, IL-6, IL-23, TNFa, IFN-y) nas três fases da doença, para ganhar conhecimento sobre os processos inflamatórios da doença. Em conclusão, os dados fornecem uma visão geral do perfil funcional das células imunitárias durante EAE patologia.

Introduction

A esclerose múltipla (MS) e a sua correspondente modelo animal, a encefalomielite autoimune experimental (EAE), mostram alterações neuroinflamação auto-imunes do sistema nervoso central (SNC). Cedo lesões de EM e EAE activas são caracterizadas pela presença de células imunes infiltradas. A etiologia da EM é desconhecida, mas é amplamente consideradas como envolvendo a destruição de mielina mediada por células T auto-reactivas. Estas células T auto-reactivas secretam citoquinas pró-inflamatórias e quimiocinas que atraem outras células imunitárias tais como células B, monócitos e neutrófilos provenientes da circulação. Os monócitos diferenciam-se em macrófagos. O interferão gama (IFN-y) secretado por células T auto-reactivas polariza os macrófagos em macrófagos pró-inflamatórias. As citocinas pró-inflamatórias macrófagos de libertação e de espécies reativas de oxigênio que promovem a apoptose em oligodendrócitos. A morte de oligodendrócitos conduz a desmielinização. Além disso, as células B diferenciam-se em pcélulas LASMA e auto-anticorpos contra a libertação da bainha de mielina, resultando na degradação de mielina. A perda de mielina leva a degradação de axónios e neurónios e, assim, para a formação de locais de lesão no SNC, que representam a característica principal de ^um MS. No sistema nervoso periférico, as células T e as células B são activadas nos nódulos linfáticos, que proliferam no baço e migram através da circulação para o sistema nervoso central. Os monócitos e neutrófilos proliferam na medula óssea e também migram através da circulação para o sistema nervoso central.

Leucócitos extravasamento a partir da medula óssea, baço e nódulos linfáticos para o sangue ou a partir da corrente sanguínea para o SNC é um processo de passos múltiplos que depende de vários factores, incluindo interacções moleculares entre leucócitos e endotélio mediadas por quimiocinas e receptores de quimiocina. A produção de quimiocinas por vários tipos de células podem ser induzidas durante a reactio imuneN por citocinas como factor de necrose tumoral-α (TNFa), IFN-y e interleucina-6 (IL-6), que, subsequentemente, recruta células imunes para o local da inflamação ^2,3. Células imunes apresentar um subconjunto de receptores de quimiocina na sua superfície, dependendo do tipo de célula e via de migração para o local inflamatório. Assim, CXCR2, CCR1 e CXCR1 são expressas em neutrófilos maduros na medula óssea e no sangue ^4, e a ligação dos seus ligandos, CXCL2, CCL5 ou CXCL6, respectivamente, activa os neutrófilos e promove a sua adesão ao endotélio e, subsequentemente, a migração das células tecidos em ^5-9. CCL2 e CCL20 atrair monócitos e células Th1 / Th17 ^10, que expressam CCR2 ¹¹ e ¹² CCR6, respectivamente. CCR1 e CCR5, expressas por diferentes tipos de células, incluindo células T, monócitos e macrófagos, ^13, ligam-se CCL3, CCL5 e CCL7 e são regulados positivamente durante ¹⁴ MS. CXCR3 é expresso em células T e liga-se CCL9, CCL10 eCCL11 ^15.

Uma estratégia principal no tratamento de MS é a depleção de células do sistema imunológico ou a prevenção da infiltração de células imunitárias para o SNC. Por isso, o bloqueio dos receptores de quimioquinas específicas tem sido investigada na EAE. Antagonismo ou eliminação genética de CCR1 ^16, CCR2 ^17, CCR7 ¹⁸ ou CXCR2 ¹⁹ reduz EAE patologia, ao passo que o antagonismo ou eliminação genética de CCR1 ^20, CCR5 ²⁰ ou CXCR3 ²¹ não reduziu a patologia. Assim, a expressão de receptores específicos de quimiocinas nos leucócitos é crucial para a infiltração do último para o SNC e determina o curso da EAE.

A depleção de células imunes é uma estratégia de tratamento eficaz para pacientes com EM, porque as células imunitárias infiltrados libertar citocinas, tais como TNFa, IL-6 e IL-1β, que, por sua vez, promovem o processo inflamatório ou a degradação dos neurónios ^22. Além disso, auto-células Th1 IFN-y reactivos solte, que por sua vez estimula os macrófagos para libertar o TNFa, IL-1β e IL-23.

Este manuscrito descreve a indução de EAE, a determinação da distribuição de células imunitárias e os níveis de citocinas (ARNm) em vários tecidos em ratinhos EAE. As células foram isoladas em diferentes pontos de tempo durante o curso da doença para fornecer uma visão geral dependente do tempo dos processos inflamatórios que conduzem finalmente à formação de lesões no sistema nervoso central.

Protocol

ÉTICA DECLARAÇÃO: Nossos procedimentos experimentais são aprovados pelo Comitê do Regierungspräsidium Darmstadt (Alemanha) Ética e confirme com os regulamentos nacionais e europeias. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de animais utilizados. 1. EAE Modelo Indução do modelo de EAE Use fêmea 129S4 / SvJae × ratinhos C57BL / 6 de 10 a 13 semanas de idade, para a indução de EAE. Dar aos ratos uma i…

Representative Results

A Figura 1 apresenta uma visão esquemática dos diferentes métodos descritos neste artigo. 1) Os ratos recebem uma injecção de 35-55 antígeno MOG e desenvolver sintomas clínicos iniciais após 10,7 ± 0,3 dias 28. Um curso da doença representativo de ratos EAE é mostrado na Figura 1. 2) de vários tecidos (baço, nódulos linfáticos, lombar da medula espinal) e no sangue são extraídos a p…

Discussion

O modelo de EAE descrito aqui tem recebido mais atenção como um modelo de MS e é utilizado rotineiramente em testar estratégias terapêuticas para MS ^32. A doença do rato apresenta muitas características clínicas e histológicas de MS e é causada pela indução de auto-imunidade a antígenos neuronais. A sensibilidade aos antigénios de mielina está associada com disfunção cerebral barreira sangue e, desse modo, a infiltração de células imunes para o SNC. Nossos resultados mostram que as célula…

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System	Applied Biosystems, Austin, USA		quantitative PCR system
Accutase	Sigma Aldrich Munich, Germany	A6964	cell detachment solution
CD3-PE-CF594	BD, Heidelberg, Germany	562286
CD4-V500	BD, Heidelberg, Germany	560782
CD8-eFluor650	eBioscience, Frankfurt, Germany	95-0081-42
CD11b-eFluor605	eBioscience, Frankfurt, Germany	93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700	BD, Heidelberg, Germany	560583
CD19-APC-H7	BD, Heidelberg, Germany	560143
CD45-Vioblue	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-910
CompBeads	BD, Heidelberg, Germany	552843	compensation beads
Collagenase A	Sigma Aldrich Munich, Germany	C0130
Cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads	BD, Heidelberg, Germany	642412
DNase I	Sigma Aldrich Munich, Germany	D5025
EAE Kit	Hooke Laboratories, Lawrence, USA	EK2110
F4/80-PE-Cy7	BioLegend, Fell, Germany	123114
First Strand cDNA-Synthesis kit	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K1612
Fc receptor-1 blocking buffer	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
Flow cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	580
FlowJo software v10	Treestar, Ashland, USA		flow cytometry software
LSRII/Fortessa	BD, Heidelberg, Germany		flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7	BD, Heidelberg, Germany	560600
Lysing solution	BD, Heidelberg, Germany	349202
Maxima SYBR Green	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K0221	fluorescent DNA binding dye
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104	RNA extraction kit