マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導
Summary
This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.
Abstract
多発性硬化症は、認知および運動障害を生じる中枢神経系（CNS）において病変形成することを特徴とする炎症性自己免疫疾患であると推定されます。それはまた、CNS内の病変形成、運動障害を特徴とし、また、自己免疫疾患および炎症反応により駆動されるので、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、MSの有用な動物モデルです。 EAEモデルの一つは、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（MOG）マウスにおける35-55に由 来するペプチドを用いて誘導されます。 EAEマウスは、進行性疾患のコースを開発しています。このコースは3つのフェーズに分かれています。前臨床段階（日0から9）、疾患の発症（日10から11）と急性期（日12から14）。 MSおよびEAEは、CNSに浸潤する自己反応性T細胞によって誘導されます。これらのT細胞は、さらに、免疫細胞の動員をもたらすケモカインおよびサイトカインを分泌します。脊髄dのため、免疫細胞の分布3疾患の段階をuringすることを検討しました。 T細胞、B細胞および単球の活性化/増殖/蓄積が開始される疾患の時点を強調するために、リンパ節、脾臓および血液中の免疫細胞の分布についても評価しました。さらに三病段階におけるいくつかのサイトカイン（IL-1β、IL-6、IL-23、TNFα、IFNγ）のレベルは、疾患の炎症過程への洞察を得るために、測定されました。結論として、データは、EAEの病理中の免疫細胞の機能プロファイルの概要を説明します。
Introduction
多発性硬化症（MS）およびその対応する動物モデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、中枢神経系（CNS）における自己免疫神経炎症の変化を示します。早期活性MSおよびEAEの病変は、浸潤免疫細胞の存在によって特徴付けられます。 MSの病因は不明であるが、広く自己反応性T細胞によって媒介ミエリンの破壊を伴うと考えられています。これらの自己反応性T細胞は、循環からのB細胞、単球および好中球などの他の免疫細胞を誘引前炎症性サイトカインおよびケモカインを分泌します。単球はマクロファージに分化します。自己反応性T細胞によって分泌されるインターフェロンγ（IFNγ）は、前炎症性マクロファージにマクロファージを偏光します。前炎症性マクロファージ放出サイトカインおよびオリゴデンドロサイトのアポトーシスを促進する活性酸素種。オリゴデンドロサイトの死は脱髄につながります。さらに、B細胞は、pに分化します細胞をlasma、最終的にミエリンの劣化が生じ、ミエリン鞘に対する自己抗体をリリース。ミエリンの喪失は、軸索及びニューロンの劣化にし、それによってMS 1の主な特徴を表すCNSにおける病変部位の形成をもたらします。周囲に、T細胞とB細胞はリンパ節において活性化され、それらは、脾臓中で増殖し、中枢神経系への循環を通って移動します。単球および好中球は骨髄で増殖し、また、中枢神経系への循環を通って移動します。
血液中へのまたはCNSへの血流からの骨髄、脾臓およびリンパ節からの白血球の血管外漏出は、ケモカインおよびケモカイン受容体によって媒介される白血球と内皮細胞との間の分子間相互作用を含むいくつかの要因に依存する多段階プロセスです。種々の細胞型によるケモカインの産生、免疫reactio中に誘導することができますその後炎症2,3の部位への免疫細胞を補充腫瘍壊死因子α（TNFα）などのサイトカイン、IFNγおよびインターロイキン6（IL-6）、によってN。免疫細胞は、炎症部位への細胞型及び移動経路に応じて、それらの表面上のケモカイン受容体のサブセットを提示します。したがって、CXCR2、CCR1とCXCR1は、骨髄や血液4で成熟した好中球上に発現し、そのリガンド、CXCL2、CCL5またはCXCL6の結合され、それぞれ、好中球を活性化し、その後、細胞の遊走を内皮細胞への接着を促進し、組織5-9に。 CCL2とCCL20はそれぞれ、CCR2 11およびCCR6 12を発現し 、単球およびTh1 / Th17細胞10を 、引き付けます。 T細胞、単球およびマクロファージを含む、13の異なる細胞型によって発現CCR1及びCCR5、CCL3、CCL5及びCCL7に結合し、MS 14の間にアップレギュレートされます。 CXCR3は、T細胞上に発現され、CCL9、CCL10に結合され、かつCCL11 15。
MSの治療における一つの主要な戦略は、免疫細胞の枯渇またはCNSへの免疫細胞の浸潤の予防です。したがって、特定のケモカイン受容体の遮断は、EAEに検討されています。拮抗作用またはCCR1 16の遺伝子欠失、CCR2 17は 、CCR7 18またはCXCR2 19は、拮抗作用またはCCR1 20の遺伝子欠失のに対し、CCR5 20またはCXCR3 21は病変を減少させなかった、EAEの病理を低減します。したがって、白血球上の特定のケモカイン受容体の発現は、CNSへの後者の浸透のために重要であり、EAEのコースを指示します。
浸潤免疫細胞は、順に、炎症過程またはニューロン22の劣化を促進し、TNFα、IL-6およびIL-1βなどのサイトカインを放出するため、免疫細胞の枯渇が、MS患者に対する有効な治療戦略です。また、自動反応性Th1細胞は、順番に、TNFα、IL-1βおよびIL-23を解放するためにマクロファージを刺激しIFNγを放出します。
この原稿は、EAEの誘導、EAEマウスの種々の組織における免疫細胞の分布とサイトカインレベル（mRNA）の決意を示しています。細胞は、最終的にCNSにおける病変形成をもたらす炎症過程の時間依存性の概要を提供するために、疾患の経過中の異なる時点で単離しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明EAEモデルは、MSのモデルとして最も注目されており、日常的にMS 32のための治療戦略を試験する際に使用されます。マウスの疾患は、MSの多くの臨床的および組織学的特徴を示し、神経細胞の抗原に対する自己免疫の誘導によって引き起こされます。ミエリン抗原に対する感作は、血液脳関門機能不全に関連し、それによって、CNSへの免疫細胞浸潤されます。我々の知見は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.
Materials
| ABI Prism 7500 Sequence Detection System | Applied Biosystems, Austin, USA | quantitative PCR system | |
| Accutase | Sigma Aldrich Munich, Germany | A6964 | cell detachment solution |
| CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germany | 562286 | |
| CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germany | 560782 | |
| CD8-eFluor650 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 95-0081-42 | |
| CD11b-eFluor605 | eBioscience, Frankfurt, Germany | 93-0112-42 | |
| CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germany | 560583 | |
| CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germany | 560143 | |
| CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-910 | |
| CompBeads | BD, Heidelberg, Germany | 552843 | compensation beads |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Munich, Germany | C0130 | |
| Cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | BLI-580-10 | |
| Cytometer Setup and Tracking beads | BD, Heidelberg, Germany | 642412 | |
| DNase I | Sigma Aldrich Munich, Germany | D5025 | |
| EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
| F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germany | 123114 | |
| First Strand cDNA-Synthesis kit | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K1612 | |
| Fc receptor-1 blocking buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| Flow cytometric absolute count standard | Polyscience, Eppelheim, Germany | 580 | |
| FlowJo software v10 | Treestar, Ashland, USA | flow cytometry software | |
| LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germany | flow cytometer | |
| Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germany | 560600 | |
| Lysing solution | BD, Heidelberg, Germany | 349202 | |
| Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | K0221 | fluorescent DNA binding dye |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | RNA extraction kit |
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