चूहे और विभिन्न ऊतकों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की रोग-निर्भर वितरण के मूल्यांकन में प्रायोगिक ऑटोइम्यून Encephalomyelitis की प्रेरण

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

मल्टीपल स्क्लेरोसिस एक भड़काऊ autoimmune रोग है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) संज्ञानात्मक और मोटर हानि, जिसके परिणामस्वरूप में घाव गठन की विशेषता है माना जाता है। क्योंकि यह भी सीएनएस में घाव गठन, मोटर हानि की विशेषता है और यह भी स्व-प्रतिरक्षित और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं से प्रेरित है प्रायोगिक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis (EAE), एमएस का एक उपयोगी पशु मॉडल है। EAE मॉडलों में से एक एक पेप्टाइड माइलिन oligodendrocyte प्रोटीन चूहों में (MOG) _35-55 से व्युत्पन्न के साथ प्रेरित है। EAE चूहों एक प्रगतिशील रोग पाठ्यक्रम का विकास। इस कोर्स के लिए तीन चरणों में बांटा गया है: preclinical चरण (0 दिन – 9), रोग की शुरुआत (दिन 10 – 11) और तीव्र चरण (12 दिन – 14)। एमएस और EAE autoreactive टी कोशिकाओं कि सीएनएस घुसपैठ से प्रेरित कर रहे हैं। ये टी कोशिकाओं chemokines और साइटोकिन्स जो आगे प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती करने के लिए नेतृत्व छिपाना। इसलिए, रीढ़ की हड्डी विकास में प्रतिरक्षा सेल वितरणतीन चरणों रोग uring जांच की गई। रोग, जिस पर सक्रियण / प्रसार / टी कोशिकाओं बी कोशिकाओं और monocytes के संचय शुरू होता है के समय बिंदु को उजागर करने के लिए, लिम्फ नोड्स, तिल्ली और रक्त में प्रतिरक्षा सेल वितरण भी मूल्यांकन किया गया था। इसके अलावा, तीन चरणों में रोग कई साइटोकिन्स (आईएल 1β, आईएल -6, आईएल 23, TNFα, IFNγ) के स्तर को निर्धारित किया गया है, रोग की सूजन प्रक्रियाओं में जानकारी हासिल करने के लिए। अंत में, डेटा EAE विकृति के दौरान प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कार्यात्मक प्रोफ़ाइल के एक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं।

Introduction

मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस) और अपनी इसी पशु मॉडल, प्रयोगात्मक autoimmune encephalomyelitis (EAE), केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में स्व-प्रतिरक्षित neuroinflammation परिवर्तन दिखा। प्रारंभिक सक्रिय एमएस और EAE घावों घुसपैठ की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति की विशेषता है। एमएस के एटियलजि अज्ञात बना हुआ है, लेकिन व्यापक रूप से autoreactive टी कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता माइलिन के विनाश को शामिल करने के लिए माना जाता है। ये autoreactive टी कोशिकाओं समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स और chemokines जो इस तरह के बी कोशिकाओं, monocytes और प्रचलन से न्यूट्रोफिल के रूप में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आकर्षित छिपाना। Monocytes मैक्रोफेज में अंतर है। इंटरफेरॉन गामा (IFNγ) autoreactive टी सेल द्वारा स्रावित समर्थक भड़काऊ मैक्रोफेज में मैक्रोफेज polarizes। समर्थक भड़काऊ मैक्रोफेज रिहाई साइटोकिन्स और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों कि oligodendrocytes में apoptosis बढ़ावा देने के। oligodendrocytes की मौत माइलिन रहित होता है। इसके अलावा, बी कोशिकाओं पी में अंतरLāsma कोशिकाओं और माइलिन आवरण के खिलाफ रिलीज स्वप्रतिपिंडों, अंततः माइलिन की गिरावट में जिसके परिणामस्वरूप। माइलिन के नुकसान एक्सोन और न्यूरॉन्स की गिरावट के लिए और इस तरह सीएनएस में घाव साइटों जो एमएस ¹ की मुख्य विशेषता का प्रतिनिधित्व करने का गठन होता है। परिधि में, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं लिम्फ नोड्स में सक्रिय कर रहे हैं, वे तिल्ली में पैदा करना और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में संचलन के माध्यम से पलायन। Monocytes और न्यूट्रोफिल अस्थि मज्जा में पैदा करना और भी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में संचलन के माध्यम से पलायन।

रक्त में या सीएनएस में खून से अस्थि मज्जा, प्लीहा और लिम्फ नोड्स से ल्युकोसैट परिस्त्राव एक multistep प्रक्रिया है कि ल्यूकोसाइट्स और endothelium chemokines और केमोकाइन रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता के बीच आणविक बातचीत सहित कई कारकों पर निर्भर करता है। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं द्वारा chemokines के उत्पादन प्रतिरक्षा reactio दौरान प्रेरित किया जा सकताट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (TNFα), IFNγ और इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), जो बाद में सूजन ^2,3 की साइट के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं रंगरूटों की तरह साइटोकिन्स द्वारा एन। प्रतिरक्षा कोशिकाओं, उनकी सतह पर केमोकाइन रिसेप्टर्स की एक सबसेट पेश भड़काऊ साइट के लिए सेल प्रकार और प्रवास मार्ग पर निर्भर करता है। इस प्रकार, CXCR2, CCR1 और CXCR1 अस्थि मज्जा और रक्त ⁴ में परिपक्व न्यूट्रोफिल पर व्यक्त कर रहे हैं, और इसके ligands, CXCL2, CCL5 या CXCL6 के बंधन, क्रमशः, न्यूट्रोफिल सक्रिय है और, कोशिकाओं के प्रवास endothelium के लिए अपने आसंजन को बढ़ावा देता है और बाद में ऊतकों ^5-9 में। CCL2 और CCL20 monocytes और Th1 / Th17 कोशिकाओं ^{10 है,} जो क्रमश: ¹¹ और CCR2 CCR6 ¹² एक्सप्रेस, आकर्षित करती हैं। CCR1 और CCR5, टी कोशिकाओं, monocytes और मैक्रोफेज ¹³ सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, द्वारा व्यक्त की, बाँध CCL3, CCL5 और CCL7 और एमएस ¹⁴ के दौरान upregulated रहे हैं। CXCR3 टी कोशिकाओं पर व्यक्त की और बांधता CCL9, CCL10 जाता है औरCCL11 ^15।

एमएस उपचार में एक मुख्य रणनीति प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कमी या सीएनएस में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ की रोकथाम है। इसलिए, विशिष्ट केमोकाइन रिसेप्टर्स की नाकाबंदी EAE में जांच की गई है। विरोध या CCR1 ^16, CCR2 ¹⁷ के आनुवंशिक विलोपन, CCR7 ¹⁸ या ¹⁹ CXCR2 EAE विकृति को कम कर देता है, जबकि विरोध या CCR1 ²⁰ के आनुवंशिक विलोपन, CCR5 ²⁰ या ²¹ CXCR3 विकृति को कम नहीं किया। इसलिए, ल्यूकोसाइट्स पर विशेष केमोकाइन रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति उत्तरार्द्ध की घुसपैठ सीएनएस में के लिए महत्वपूर्ण है और EAE के पाठ्यक्रम पैदा करती है।

क्योंकि घुसपैठ की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इस तरह के TNFα, आईएल -6 और आईएल 1β, जो, बारी में, भड़काऊ प्रक्रिया या न्यूरॉन्स ²² की गिरावट को बढ़ावा देने के रूप में साइटोकिन्स, रिलीज प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कमी, एमएस रोगियों के लिए एक प्रभावी उपचार की रणनीति है। इसके अलावा, ऑटोप्रतिक्रियाशील Th1 कोशिकाओं IFNγ, जो बारी में TNFα, आईएल 1β और आईएल -23 जारी करने के लिए उत्तेजित करता है मैक्रोफेज जारी।

यह पांडुलिपि EAE, प्रतिरक्षा सेल वितरण और साइटोकाइन स्तर (mRNA) EAE चूहों में विभिन्न ऊतकों में के निर्धारण की प्रेरण का वर्णन है। प्रकोष्ठों की बीमारी के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर अलग थे भड़काऊ प्रक्रिया है जिसके अंत में सीएनएस में घाव गठन के लिए नेतृत्व की एक समय पर निर्भर सिंहावलोकन प्रदान करने के लिए।

Protocol

नैतिकता वक्तव्य: हमारे प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं Regierungspräsidium Darmstadt (जर्मनी) की आचार समिति ने मंजूरी दे दी है और राष्ट्रीय और यूरोपीय नियमों की पुष्टि कर रहे हैं। सभी प्रयासों पशु पीड़ा को कम करने और प्रयुक्त ?…

Representative Results

चित्रा 1 इस आलेख में वर्णित विभिन्न तरीकों में से एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन देता है। 1) चूहे MOG 35-55 प्रतिजन का एक इंजेक्शन प्राप्त करते हैं और 10.7 ± 0.3 दिनों 28 के बाद प्रारंभिक न?…

Discussion

EAE मॉडल यहाँ वर्णित एमएस की एक मॉडल के रूप में सबसे अधिक ध्यान दिया गया है और नियमित रूप से एमएस ³² के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के परीक्षण में इस्तेमाल किया जाता है। माउस रोग एमएस के कई नैदानिक ​​और histologi…

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System	Applied Biosystems, Austin, USA		quantitative PCR system
Accutase	Sigma Aldrich Munich, Germany	A6964	cell detachment solution
CD3-PE-CF594	BD, Heidelberg, Germany	562286
CD4-V500	BD, Heidelberg, Germany	560782
CD8-eFluor650	eBioscience, Frankfurt, Germany	95-0081-42
CD11b-eFluor605	eBioscience, Frankfurt, Germany	93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700	BD, Heidelberg, Germany	560583
CD19-APC-H7	BD, Heidelberg, Germany	560143
CD45-Vioblue	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-910
CompBeads	BD, Heidelberg, Germany	552843	compensation beads
Collagenase A	Sigma Aldrich Munich, Germany	C0130
Cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads	BD, Heidelberg, Germany	642412
DNase I	Sigma Aldrich Munich, Germany	D5025
EAE Kit	Hooke Laboratories, Lawrence, USA	EK2110
F4/80-PE-Cy7	BioLegend, Fell, Germany	123114
First Strand cDNA-Synthesis kit	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K1612
Fc receptor-1 blocking buffer	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
Flow cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	580
FlowJo software v10	Treestar, Ashland, USA		flow cytometry software
LSRII/Fortessa	BD, Heidelberg, Germany		flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7	BD, Heidelberg, Germany	560600
Lysing solution	BD, Heidelberg, Germany	349202
Maxima SYBR Green	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K0221	fluorescent DNA binding dye
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104	RNA extraction kit