Induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos mus og evaluering av sykdom avhengige Fordeling av immunceller i ulike vev

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

Multippel sklerose er antatt å være en inflammatorisk autoimmun sykdom, som er kjennetegnet ved lesjonsdannelse i sentralnervesystemet (CNS) som resulterer i kognitiv og motorisk svekkelse. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en nyttig dyremodell av MS, fordi det er også karakterisert ved lesjonsdannelse i CNS, motorfunksjon og er også drevet av autoimmune og inflammatoriske reaksjoner. Ett av EAE-modeller er indusert med et peptid avledet fra myelin oligodendrocytt protein (MOG) _35-55 i mus. EAE mus utvikler en progressiv sykdomsforløpet. Dette kurset er delt inn i tre faser: preklinisk fase (dag 0-9), sykdomsutbruddet (dag 10-11) og den akutte fasen (dag 12-14). MS og EAE induseres av autoreaktive T-celler som infiltrerer CNS. Disse T-cellene utskiller kjemokiner og cytokiner som fører til rekruttering av ytterligere immunceller. Derfor immunceller fordelingen i ryggmargen dUrering tre sykdomsfaser ble undersøkt. For å markere tidspunktet av sykdommen hvor aktivering / spredning / opphopning av T-celler, B-celler og monocytter starter, ble immunceller fordelingen i lymfeknuter, milt og blod også vurderes. Videre ble nivåene av flere cytokiner (IL-1, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) i de tre fasene sykdoms bestemt, for å få innsikt i inflammatoriske prosesser av sykdommen. I konklusjonen, data gi en oversikt over den funksjonelle profilen av immunceller i løpet av EAE patologi.

Introduction

Multippel sklerose (MS) og dens tilsvarende dyremodell, eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), viser autoimmune nevroinflammasjon endringer i sentralnervesystemet (CNS). Tidlig aktive MS- og EAE-lesjoner er karakterisert ved tilstedeværelsen av infiltrerte immunceller. Årsaken til MS er fortsatt ukjent, men er ansett å innebære ødeleggelse av myelin mediert av autoreaktive T-celler. Disse autoreaktive T-celler utskiller pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner som tiltrekker andre immunceller slik som B-celler, monocytter og nøytrofile celler fra sirkulasjonen. Monocytter differensieres til makrofager. Interferon gamma (IFNy) som utskilles av autoreaktive T-celle-polariserer makrofagene til pro-inflammatoriske makrofager. Den pro-inflammatoriske makrofager utslipp cytokiner og reaktive oksygenforbindelser som fremmer apoptose i oligodendrocytes. Død av de oligodendrocytes fører til demyelinisering. Videre B-celler differensieres til plasma celler og utslipp autoantistoffer mot myelin skjede, til slutt resulterer i nedbrytning av myelin. Tapet av myelin fører til nedbrytning av axoner og nerveceller, og derved til dannelsen av lesjon områder i CNS som representerer de viktigste kjennetegn av ^MS-en. I periferien, blir T-celler og B-celler aktivert i lymfeknutene, sprer de i milten og vandrer gjennom sirkulasjonen inn i det sentrale nervesystemet. Monocytter og nøytrofile celler prolifererer i benmargen og også migrere gjennom sirkulasjonen inn i det sentrale nervesystemet.

Leukocytt ekstravasjon fra benmarg, milt og lymfeknuter i blodet eller fra blodet inn i CNS er en flertrinns prosess som er avhengig av flere faktorer, blant molekylære interaksjoner mellom leukocytter og endotel formidlet av kjemokiner og kjemokinreseptorer. Produksjonen av kjemokiner ved hjelp av forskjellige celletyper kan bli indusert i løpet av immun reaction av cytokiner som tumornekrosefaktor-α (TNF-alfa), IFNy og interleukin-6 (IL-6), som deretter rekrutterer immunceller til stedet av betennelse ^2,3. Immunceller presentere et delsett av kjemokin reseptorer på sin overflate, avhengig av celletype og migrering vei til inflammatorisk sete. Således er CXCR2, CCR1 og CXCR1 uttrykt på modne neutrofiler i benmarg og blod ^4, og binding av dets ligander, CXCL2, CCL5 eller CXCL6, henholdsvis, aktiverer neutrofiler og fremmer deres adhesjon til endotel og deretter, migrering av cellene i vev ^5-9. CCL2 og CCL20 tiltrekke monocytter og Th1 / Th17 celler ¹⁰ som uttrykker CCR2 ¹¹ og CCR6 ^12, henholdsvis. CCR1 og CCR5, uttrykt av forskjellige celletyper, inkludert T-celler, monocytter og makrofager ^13, fell CCI3, CCL5 og CCL7 og blir oppregulert ved MS ^14. CXCR3 er uttrykt på T-celler og binder CCL9, CCL10 ogCCL11 ^15.

En hovedstrategi i MS behandling er uttømming av immunceller eller forebygging av immuncelleinfiltrasjon inn i CNS. Derfor har blokaden av spesifikke kjemokinreseptorer blitt undersøkt i EAE. Antagonisme eller genetisk sletting av CCR1 ^16, CCR2 ^17, CCR7 ¹⁸ eller CXCR2 ¹⁹ reduserer EAE patologi, mens antagonisme eller genetisk sletting av CCR1 ^20, gjorde CCR5 ²⁰ eller CXCR3 ²¹ ikke redusere patologi. Derfor er uttrykket av spesifikke kjemokinreseptorer på leukocytter avgjørende for infiltrasjon av den sistnevnte inn i CNS og dikterer løpet av EAE.

Uttømming av immunceller er en effektiv behandlingsstrategi for MS-pasienter, fordi infiltrerte immunceller frigjør cytokiner, slik som TNFa, IL-6 og IL-1β, som i sin tur fremme den inflammatoriske prosessen eller nedbrytning av nerveceller ^22. Videre auto-reaktive Th1-celler frigjør IFNy, som i sin tur stimulerer makrofager til å frigjøre TNFa, IL-1β og IL-23.

Dette manuskriptet beskriver induksjon av EAE, bestemmelse av immunceller fordeling og cytokinnivåer (mRNA) i forskjellige vev i EAE mus. -Celler ble isolert ved forskjellige tidspunkter i løpet av sykdomsforløpet for å tilveiebringe en tidsavhengig oversikt over de inflammatoriske prosesser som til slutt fører til lesjonsdannelse i CNS.

Protocol

ETIKK UTTALELSE: Våre eksperimentelle prosedyrer godkjent av etikkomiteen av Regierungspräsidium Darmstadt (Tyskland) og bekrefte overfor nasjonale og europeiske forskrifter. Alle forsøk ble gjort for å minimalisere dyr lidelse og redusere antall dyr benyttet. 1. EAE Model Induksjon av EAE modellen Bruk 10 til 13 uker gamle kvinnelige 129S4 / SvJae × C57BL / 6 mus for induksjon av EAE. Gir musene subkutan injeksjon, inn i den øvre og nedre del av ryggen, a…

Representative Results

Figur 1 gir en skjematisk oversikt over de forskjellige fremgangsmåter som er beskrevet i denne artikkelen. 1) Mus som mottar en injeksjon av MOG 35-55 antigen og utvikle de første kliniske symptomene etter 10,7 ± 0,3 dager 28. En representativ sykdomsforløpet av EAE mus er vist i figur 1. 2) Forskjellige vev (milt, lymfeknuter, lumbar ryggmargen) og blod blir trukket ut fra styre- og EAE mus ve…

Discussion

EAE modellen beskrevet her har fått mest oppmerksomhet som en modell for MS og blir rutinemessig anvendt ved testing av terapeutiske strategier for MS ^32. Musen sykdom oppviser mange kliniske og histologiske trekk ved MS og skyldes induksjon av autoimmunitet til neuronale antigener. Sensibilisering til myelin-antigener er forbundet med blod-hjerne-barrieren dysfunksjon og derved immuncelleinfiltrasjon inn i CNS. Våre funn viser at immunceller øker forbigående i lymfeknutene i den akutte fasen. Milt-T-cell…

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System	Applied Biosystems, Austin, USA		quantitative PCR system
Accutase	Sigma Aldrich Munich, Germany	A6964	cell detachment solution
CD3-PE-CF594	BD, Heidelberg, Germany	562286
CD4-V500	BD, Heidelberg, Germany	560782
CD8-eFluor650	eBioscience, Frankfurt, Germany	95-0081-42
CD11b-eFluor605	eBioscience, Frankfurt, Germany	93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700	BD, Heidelberg, Germany	560583
CD19-APC-H7	BD, Heidelberg, Germany	560143
CD45-Vioblue	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-910
CompBeads	BD, Heidelberg, Germany	552843	compensation beads
Collagenase A	Sigma Aldrich Munich, Germany	C0130
Cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads	BD, Heidelberg, Germany	642412
DNase I	Sigma Aldrich Munich, Germany	D5025
EAE Kit	Hooke Laboratories, Lawrence, USA	EK2110
F4/80-PE-Cy7	BioLegend, Fell, Germany	123114
First Strand cDNA-Synthesis kit	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K1612
Fc receptor-1 blocking buffer	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-092-575
Flow cytometric absolute count standard	Polyscience, Eppelheim, Germany	580
FlowJo software v10	Treestar, Ashland, USA		flow cytometry software
LSRII/Fortessa	BD, Heidelberg, Germany		flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7	BD, Heidelberg, Germany	560600
Lysing solution	BD, Heidelberg, Germany	349202
Maxima SYBR Green	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	K0221	fluorescent DNA binding dye
RNeasy Mini Kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104	RNA extraction kit