JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Induktion av experimentell autoimmun encefalomyelit hos möss och utvärdering av sjukdomen beroende Distribution av immunceller i olika vävnader

Published: May 08, 2016
doi:
10.3791/53933
, , , , , ,
1Institute of Clinical Pharmacology,Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology,Fraunhofer IME

Summary

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Abstract

Multipel skleros antas vara en inflammatorisk autoimmun sjukdom, som kännetecknas av lesionsbildning i det centrala nervsystemet (CNS) resulterar i kognitiv och motorisk försämring. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en användbar djurmodell av MS, eftersom den kännetecknas också av lesionsbildning i CNS, motorisk försämring och är också driven av autoimmuna och inflammatoriska reaktioner. En av EAE-modeller induceras med en peptid härledd från myelin oligodendrocyt protein (MOG) 35-55 i möss. De EAE-möss utvecklar ett progressivt sjukdomsförlopp. Denna kurs är indelad i tre faser: den prekliniska fasen (dag 0-9), sjukdomsdebut (dag 10-11) och den akuta fasen (dag 12-14). MS och EAE induceras av autoreaktiva T-celler som infiltrerar CNS. Dessa T-celler utsöndrar kemokiner och cytokiner som leder till rekrytering av ytterligare immunceller. Därför immuncellfördelning i ryggmärgen dnder de tre sjukdomsfaserna undersöktes. För att markera tiden punkt av sjukdomen vid vilken aktiveringen / proliferation / ackumulering av T-celler, B-celler och monocyter startar, var immuncellfördelningen i lymfkörtlar, mjälte och blod också bedömas. Dessutom var nivåerna av flera cytokiner (IL-1, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) i de tre sjukdomsfaserna bestäms, för att få en inblick i de inflammatoriska processerna av sjukdomen. Sammanfattningsvis data ger en överblick över den funktionella profil av immunceller under EAE patologi.

Introduction

Multipel skleros (MS) och dess motsvarande djurmodell, experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE), visar autoimmuna neuroinflammation förändringar i det centrala nervsystemet (CNS). Tidigt aktiva MS- och EAE-lesioner kännetecknas av närvaron av infiltrerade immunceller. Orsaken till MS är okänd, men anses allmänt innebära förstörelsen av myelin förmedlas av autoreaktiva T-celler. Dessa autoreaktiva T-celler utsöndrar proinflammatoriska cytokiner och kemokiner som attraherar andra immunceller, såsom B-celler, monocyter och neutrofiler från cirkulationen. Monocyter differentierar till makrofager. Interferon-gamma (IFNy) utsöndras av autoreaktiva T-celler polariserar makrofagerna till pro-inflammatoriska makrofager. De proinflammatoriska makrofager frisättning cytokiner och reaktiva syreradikaler som främjar apoptos i oligodendrocyter. Döden av oligodendrocyter leder till demyelinisering. Dessutom B-celler differentierar till pLasma celler och frisättning autoantikroppar mot myelinskidan, i slutändan resulterar i nedbrytning av myelin. Förlusten av myelin leder till nedbrytning av axoner och neuroner och därigenom till bildandet av skadeställen i CNS som utgör den huvudsakliga kännetecken för MS 1. I periferin, är T-celler och B-celler aktiverade i lymfkörtlarna, de förökar i mjälten och migrera genom omsättning i det centrala nervsystemet. Monocyter och neutrofiler prolifererar i benmärgen och även migrerar genom omsättning i det centrala nervsystemet.

Leukocyter extravasering från benmärg, mjälte och lymfkörtlar i blodet eller från blodet in i CNS är en flerstegsprocess som beror på flera faktorer, bland annat molekylära interaktioner mellan leukocyter och endotel förmedlas av kemokiner och kemokinreceptorer. Produktion av kemokiner av olika celltyper kan induceras under immun reaction av cytokiner såsom tumörnekrosfaktor-α (TNFa), IFNy och interleukin-6 (IL-6), som därefter rekryterar immunceller till stället för inflammation 2,3. Immunceller presentera en delmängd av kemokinreceptorer på deras yta, beroende på celltyp och migration väg till inflammationsstället. Således CXCR2, CCR1 och CXCR1 uttrycks på mogna neutrofiler i benmärgen och blodet 4, och bindning av dess ligander, CXCL2, CCL5 eller CXCL6 respektive aktiverar neutrofiler och främjar deras vidhäftning till endotelet och därefter migrationen av celler i vävnaderna 5-9. CCL2 och CCL20 attrahera monocyter och Th1 / Th17-celler 10, vilka uttrycker CCR2 11 och CCR6 12, respektive. CCR1 och CCR5, som uttrycks av olika celltyper, innefattande T-celler, monocyter och makrofager 13, binder CCL3, CCL5 och CCL7 och uppregleras under MS 14. CXCR3 uttrycks på T-celler och binder CCL9, CCL10 ochCCL11 15.

En huvudstrategi i MS behandling är utarmningen av immunceller eller förhindrande av immuncellinfiltration in i CNS. Därför har blockaden av specifika kemokinreceptorer undersökts i EAE. Antagonism eller genetisk deletion av CCR1 16, CCR2 17 CCR7 18 eller CXCR2 19 minskar EAE patologi, medan antagonism eller genetisk deletion av CCR1 20, gjorde CCR5 20 eller CXCR3 21 inte minska patologin. Följaktligen är uttrycket av specifika kemokinreceptorer på leukocyter avgörande för infiltration av den senare in i CNS och dikterar loppet av EAE.

Utarmning av immunceller är en effektiv metod för att behandla MS-patienter, eftersom infiltrerade immunceller frisätta cytokiner, såsom TNFa, IL-6 och IL-1β, vilket i sin tur främjar den inflammatoriska processen, eller nedbrytning av neuroner 22. Vidare auto-reaktiva Th1-celler frisätta IFNy, som i sin tur stimulerar makrofager att frisätta TNFa, IL-1β och IL-23.

Detta manuskript beskriver induktion av EAE, bestämningen av immuncellfördelningen och cytokinnivåer (mRNA) i olika vävnader i EAE-möss. Celler isolerades vid olika tidpunkter under sjukdomsförloppet för att åstadkomma en tidsberoende översikt över de inflammatoriska processer som slutligen leder till lesionsbildning i CNS.

Protocol

ETIK ANALYS: Våra experimentella procedurer är godkända av etikkommittén Regierungspräsidium Darmstadt (Tyskland) och bekräfta för Nationella och europeiska regler. Alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och minska antalet djur som används. 1. EAE Modell Induktion av EAE-modellen Använd 10- till 13-veckor gamla kvinnliga 129S4 / SvJae x C57BL / 6 möss för induktionen av EAE. Ge mössen en subkutan injektion i den övre och nedr…

Representative Results

Figur 1 ger en schematisk översikt av de olika metoder som beskrivs i den här artikeln. 1) Möss får en injektion av MOG 35-55 antigen och utveckla första kliniska symptom efter 10,7 ± 0,3 dagar 28. Ett representativt sjukdomsförlopp av EAE-möss visas i figur 1. 2) olika vävnader (mjälte, lymfkörtlar, ländryggen ryggmärg) och blod utvinns ur kontroll och EAE-möss vid olika tidpunkter un…

Discussion

EAE modell som beskrivs här har fått mest uppmärksamhet som en modell av MS och används rutinmässigt testa terapeutiska strategier för MS 32. Musen sjukdom uppvisar många kliniska och histologiska funktioner i MS och orsakas av induktion av autoimmunitet mot neuronala antigener. Den sensibilisering mot myelinantigener är associerad med blodhjärnbarriären dysfunktion och därmed, immuncellinfiltration i CNS. Våra resultat visar att immunceller ökar transient i lymfkörtlarna i den akuta fasen. Mjä…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation – Pharma (TRIP) and by the “Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung” of the State of Hesse.

Materials

ABI Prism 7500 Sequence Detection System  Applied Biosystems, Austin, USA quantitative PCR system
Accutase Sigma Aldrich Munich, Germany A6964 cell detachment solution
CD3-PE-CF594 BD, Heidelberg, Germany 562286
CD4-V500 BD, Heidelberg, Germany 560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Frankfurt, Germany 95-0081-42
CD11b-eFluor605 eBioscience, Frankfurt, Germany 93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700 BD, Heidelberg, Germany 560583
CD19-APC-H7  BD, Heidelberg, Germany 560143
CD45-Vioblue  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-910
CompBeads BD, Heidelberg, Germany 552843 compensation beads
Collagenase A Sigma Aldrich Munich, Germany C0130
Cytometric absolute count standard  Polyscience, Eppelheim, Germany BLI-580-10
Cytometer Setup and Tracking beads  BD, Heidelberg, Germany 642412
DNase I Sigma Aldrich Munich, Germany D5025
EAE Kit Hooke Laboratories, Lawrence, USA EK2110
F4/80-PE-Cy7  BioLegend, Fell, Germany 123114
First Strand cDNA-Synthesis kit  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K1612
Fc receptor-1 blocking buffer  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
Flow cytometric absolute count standard Polyscience, Eppelheim, Germany 580
FlowJo software v10  Treestar, Ashland, USA flow cytometry software
LSRII/Fortessa  BD, Heidelberg, Germany flow cytometer
Ly6G-APC-Cy7  BD, Heidelberg, Germany 560600
Lysing solution  BD, Heidelberg, Germany 349202
Maxima SYBR Green  Thermo Scientific, Schwerte, Germany K0221 fluorescent DNA binding dye 
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104 RNA extraction kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409 (2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187 (2014).
  13. Katschke, K. J., et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136 (2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. ‘t Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler’s murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

Tags

Keywords: Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE)Multiple SclerosisDemyelinationImmune Cell InfiltrationMiceMyelin Oligodendrocyte GlycoproteinComplete Freund’s AdjuvantPertussis ToxinLymph NodeSpinal CordClinical Symptoms
check_url/53933?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Barthelmes, J., Tafferner, N., Kurz, J., de Bruin, N., Parnham, M. J., Geisslinger, G., Schiffmann, S. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J. Vis. Exp. (111), e53933, doi:10.3791/53933 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image