Procedimiento para evaluar la eficacia de floculantes para la eliminación de partículas dispersas en extractos de plantas
Summary
The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Abstract
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
Introduction
Las plantas son ampliamente utilizados para producir productos alimenticios tales como zumos de frutas, sino que también pueden ser desarrolladas como plataformas para la fabricación de de mayor valor productos biofarmacéuticos 1-3. En ambos casos, el procesamiento aguas abajo (DSP) a menudo comienza con la extracción de los líquidos de los tejidos, tales como hojas o frutos, seguida de la clarificación de los extractos de partículas cargadas de 4,5. Para la fabricación de productos biofarmacéuticos, los costos de DSP pueden representar hasta el 80% de los costes totales de producción 6,7 y esto refleja en parte la elevada carga de partículas presentes en los extractos preparados por métodos disruptivos tales como la homogeneización a base de hoja de 8,9 . Aunque la selección racional de las capas de filtro para que coincida con la distribución del tamaño de partícula en el extracto puede aumentar la capacidad del filtro y reducir los costos de 10,11, la mejora nunca puede exceder el límite máximo de capacidad absoluta definida por el número de partículas que debe ser retenido porunidad de área de filtro para lograr aclaración.
El techo se puede levantar si menos partículas llegan a la superficie de los mejores filtros en el tren de la filtración, y esto se puede conseguir si las partículas dispersas se mezclan con polímeros conocidos como floculantes que promueven la agregación para formar flóculos grandes 12. Tales flóculos se pueden retener más aguas arriba por los filtros de bolsa más gruesas y menos caros, reduciendo la carga de partículas de llegar a la más fina y filtros de profundidad más caros. Los polímeros deben tener un perfil de seguridad adecuadas para sus aplicaciones, por ejemplo para productos biofarmacéuticos que debe ser compatible con las buenas prácticas de fabricación (GMP), y por lo general tienen que tener una masa molecular> 100 kDa y pueden ser o bien neutro o cargado 13. Considerando floculantes neutros actúan generalmente por reticulación de partículas dispersas causar su agregación y la formación de flóculos con diámetros> 1 mm 11, polímeros cargados neutralizan la carga de dpartículas ispersed, reduciendo su solubilidad y por lo tanto causando precipitación 14.
La floculación se puede mejorar mediante el ajuste de parámetros tales como el pH del tampón o la conductividad, y el tipo de polímero o de la concentración, para que coincida con las propiedades del extracto de 15,16. Para extractos de tabaco tratados previamente con 0,5 a 5,0 g L -1 polietilenimina (PEI), un aumento de más de 2 veces en la capacidad de filtro de profundidad se informó en un proceso a escala piloto 100-L. El costo de este polímero es inferior a € 10 kg-1 por lo que su introducción en el proceso resultó en un ahorro de costes de alrededor de € 6.000 para filtros y consumibles por lote 16 o incluso más cuando se combinan con las ayudas de filtro a base de celulosa 17. Aun así, se requieren modelos predictivos para evaluar los beneficios económicos de floculantes a priori debido a que su inclusión puede requerir pasos de retención de 15-30 minutos 16,18, lo que resulta en mayores costos de inversión para el almacenamientotanques. Sin embargo, actualmente no hay disponibles modelos mecánicos que pueden predecir el resultado de tales experimentos debido a la naturaleza compleja de la floculación. Por lo tanto, un enfoque de diseño de experimentos-de-más apropiadas (DoE) 19 fue desarrollado como se describe en este artículo. Un protocolo para el procedimiento general del Departamento de Energía ha sido recientemente publicada el 20.
Dispositivos de pequeña escala están ahora disponibles para la selección de alto rendimiento de las condiciones de floculación 21. Sin embargo, estos dispositivos no pueden simular de forma realista las condiciones durante la floculación de extractos de plantas debido a las dimensiones del recipiente de reacción (~ 7 mm para los pozos en una placa de 96 pocillos) y las partículas o flóculos pueden ser de menos de un orden de magnitud de diferencia. Esto puede afectar a los patrones y por lo tanto la capacidad de predicción del modelo de mezcla. Además, puede ser difícil de bajar los procesos que implican precipitación debido a los cambios no lineales en el comportamiento de mezcla y sta precipitadobilidad 22. Por lo tanto, este artículo se describe un sistema de detección de sobremesa escala con un rendimiento de 50-75 muestras por día, produciendo resultados que son escalables a partir del volumen de reacción de 20 ml inicial a un proceso a escala piloto de 100 L 16. Cuando se combina con un enfoque DoE, esto permite que los modelos de predicción que se utilizarán para la optimización de procesos y la documentación como parte de un concepto de calidad a través del diseño.
El método descrito a continuación también puede adaptarse para productos biofarmacéuticos producidos en procesos basados en cultivo celular, donde floculantes también están siendo considerados como una herramienta para disminuir los gastos 23. También puede ser utilizado para modelar la precipitación de proteínas diana de un extracto bruto como parte de una estrategia de purificación, como se ha demostrado para β-glucuronidasa producida en canola, maíz y soja 24,25. Una descripción detallada de las propiedades floculantes se puede encontrar en otras partes 16,26 y es importante para asegurar que el polímero concentrciones son ya sea no tóxico o por debajo de niveles perjudiciales en el producto final 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aspecto más importante a tener en cuenta al configurar un DoE para caracterizar la floculación de las partículas es que el diseño debe, en principio, ser capaz de detectar y describir los efectos esperados o posibles 36,38, por ejemplo, la influencia del pH, tipo de polímero y concentración de polímero 16. Por lo tanto, es importante para evaluar la fracción de espacio de diseño (FDS) antes de comenzar los experimentos reales. La FDS es la fracción del espacio experimental mul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
Materials
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
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