Vorgehensweise Um die Effizienz von Flockungsmittel für die Beseitigung von Dispersed Partikel aus Pflanzenextrakten zur Bewertung

Summary

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Abstract

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Introduction

Pflanzen sind weit verbreitet zu produzieren Nahrungsmittelrohstoffe wie Fruchtsäfte verwendet, aber sie können auch als Plattform für die Herstellung von höherwertigen biopharmazeutischen Produkten ^1-3 entwickelt werden. In beiden Fällen wird der Weiterverarbeitung (DSP) beginnt häufig mit der Entnahme von Flüssigkeiten aus dem Gewebe wie Blätter oder Früchte, gefolgt von der Klärung der partikelbeladenen Extrakte ^4,5. Für die Herstellung von Biopharmazeutika, können die Kosten für die DSP machen bis zu 80% der gesamten Produktionskosten ^6,7 und dies spiegelt teilweise die hohe Partikelbelastung in Extrakten durch disruptive Methoden wie Blade-basierte Homogenisierung hergestellt ^8,9 . Obwohl die rationale Auswahl der Filterschichten kann die Partikelgrößenverteilung in dem Extrakt auf Filterkapazität zu erhöhen und die Kosten ^10,11 reduzieren, kann die Verbesserung nicht durch die Anzahl von Partikeln definiert , die Obergrenze der absolute Kapazität überschreiten , die pro aufbewahrt werden müssenEinheit Filterfläche Klärung zu erreichen.

Die Decke kann aufgehoben werden , wenn weniger Partikel die Oberfläche der feinsten Filter in der Filterstrang gelangen, und dies kann , wenn dispergierte Teilchen vermischt sind mit Polymeren als Flockungsmittel bekannt , erreicht werden, die die Aggregation fördern ¹² große Flocken zu bilden. Solche Flocken können weiter stromaufwärts durch gröbere und weniger teuer Beutelfilter zurückgehalten werden, um die Partikelbelastung Verringerung der feineren erreichen und teurer Tiefenfilter. Die Polymere müssen Sicherheitsprofile haben für ihre Anwendungen, zB für Biopharmazeutika sie mit der guten Herstellungspraxis (GMP) entsprechen müssen, und in der Regel müssen sie eine Molmasse> 100 kDa haben und entweder neutral oder ¹³ aufgeladen werden kann. Während neutral Flockungsmittel deren Aggregation und die Bildung von Flocken mit einem Durchmesser handeln , im allgemeinen durch Vernetzung dispergierten Teilchen verursacht> 1 mm ^11, neutralisieren geladene Polymere die Ladung von dispersed Partikel, wodurch ihre Löslichkeit und damit verursachenden Niederschläge ^14.

Flockung kann durch Einstellen Parameter wie pH oder Leitfähigkeit und der Polymertyp oder der Konzentration verbessert werden, ^15,16 , die Eigenschaften des Extrakts zu entsprechen. Tabakextrakte vorbehandelt mit 0,5-5,0 g L ^-1 Polyethylenimin (PEI), eine mehr als 2-fache Erhöhung der Tiefenfilterkapazität wurde in einer 100-L Pilotmaßstab Prozess berichtet. Die Kosten für dieses Polymers weniger als 10 € kg ^-1 , so dass ihre Einführung in den Prozess zu Kosteneinsparungen geführt von ca. 6.000 € für Filter und Verbrauchsmaterialien pro Charge ¹⁶ oder sogar noch mehr , wenn sie mit Cellulosebasis Filterhilfsmittel ¹⁷ kombiniert. Trotzdem sind Vorhersagemodelle erforderlich , um die a priori wirtschaftlichen Nutzen von Flockungsmitteln zu bewerten , da die Einbeziehung halten Schritten von 15-30 min ^16,18 erfordern kann, was zu einer weiteren Investitionskosten für die LagerungPanzer. Es gibt jedoch noch keine mechanistische Modelle zur Verfügung, um das Ergebnis dieser Experimente aufgrund der komplexen Natur der Flockung vorhersagen kann. Daher ist ein geeignetes Design-of-Experiments (DoE) Ansatz ¹⁹ wurde wie in diesem Artikel beschrieben entwickelt. Ein Protokoll für die allgemeine DoE Verfahren wurde kürzlich ²⁰ veröffentlicht.

Kleines Geräte sind ab sofort verfügbar für das Hochdurchsatz – Screening von Flockungsbedingungen ^21. Jedoch können diese Vorrichtungen nicht realistisch Bedingungen während der Ausflockung von Pflanzen simulieren extrahiert, da die Abmessungen des Reaktionsgefäßes (~ 7 mm für die Vertiefungen auf einer Platte mit 96 Vertiefungen) und die Partikel oder Flocken kann weniger als eine Größenordnung auseinander. Dies kann Mischmuster beeinflussen und damit die Vorhersagekraft des Modells. Darüber hinaus kann es schwierig sein, Prozesse zu verringern Präzipitation denen aufgrund nicht-linearen Änderungen des Mischungsverhalten und Präzipitat stabilität ^22. Daher beschreibt dieser Artikel eine Bank-top-Skala – Screening – System mit einem Durchsatz von 50 bis 75 Proben pro Tag, Ergebnisse liefert , die von der anfänglichen 20 ml Reaktionsvolumen auf einer 100 l – Pilotmaßstab Prozess ¹⁶ skalierbar sind. Wenn es mit einem DoE Ansatz kombiniert, ermöglicht dies die Vorhersagemodelle für die Prozessoptimierung und Dokumentation im Rahmen eines Qualitäts-by-Design-Konzept verwendet werden.

Das nachfolgend beschriebene Verfahren kann auch auf Biopharmazeutika angepasst werden produziert in der Zellkultur-basierten Verfahren, bei denen Flockungsmittel auch als kostensparende Werkzeug ²³ in Betracht gezogen werden. Es kann auch die Ausfällung von Zielproteinen aus einem Rohextrakt zu modellieren als Teil eines Reinigungsstrategie verwendet werden, wie für die β-Glucuronidase in Raps, Mais und Soja ^24,25 hergestellt demonstriert. Eine detaillierte Beschreibung der Flockungsmittel Eigenschaften können an anderer Stelle werden ^16,26 und es ist wichtig , um sicherzustellen , dass das Polymer Konzentr gefundentionen sind entweder nicht-toxische oder unter schädlichen Mengen im Endprodukt ^11.

Protocol

1. Entwickeln Sie eine angemessene experimentelle Strategie Identifizieren Sie die Umwelt- und Prozessparameter , die relevant sind für die Flockung Verfahren festgelegt oder optimiert werden, das heißt , welche Faktoren den stärksten Effekt auf Flockung haben. Typischerweise gibt es mehrere solche Parameter so ein Ansatz DoE wie kürzlich beschrieben 20 aufgrund des Fehlens von mechanistischen Modelle notwendig. Wählen Sie die Parameter (Faktoren) auf Basis von Literaturdaten…

Representative Results

Flockung von Tabakextrakt mit verschiedenen Polymeren Das oben beschriebene Verfahren wurde erfolgreich ein Verfahren zu entwickeln für die Ausflockung von Tabakextrakte bei der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers (der HIV-neutralisierenden Antikörper 2G12) und ein fluoreszierendes Protein (DsRed) (Abbildung 1) 16 verwendet und ist seit übertragen auf andere Proteine ​​einschließlich…

Discussion

Der wichtigste Aspekt zu berücksichtigen , wenn eine DoE Einrichtung Partikel Flockung zu charakterisieren , ist , dass das Design grundsätzlich in der Lage sein müssen , um die zu erwartenden oder möglichen Auswirkungen ^36,38, zB der Einfluss von pH – Wert, Polymertyp und Polymerkonzentration ¹⁶ erfassen und zu beschreiben. Daher ist es wichtig, den Anteil des Bauraums (FDS) vor Beginn der eigentlichen Experimente zu bewerten. Die FDS ist der Anteil des mehrdimensionalen Versuchsraum …

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Catiofast VSH	BASF	79002360	Flocculating agent
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chitosan	Carl Roth GmbH	5375.1	Flocculating agent
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K700P 60D	Pall	5302305	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Polymin P	BASF	79002360	Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Homogenization device with custom blade tool
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement