Prosedür bitki özleri gelen Dağınık Parçacıkların çıkarması için Flokülantlar Verimliliği değerlendirin
Summary
The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Abstract
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
Introduction
Bitkiler yaygın olarak meyve suları gibi gıda malları üretmek için kullanılır, ancak aynı zamanda daha yüksek değer biyofarmasötik ürünlerin 1-3 imalatı için platformlar olarak geliştirilebilir. Her iki durumda da, ayırma işlemleri (DSP) çoğu zaman partikül yüklü özler 4,5 açıklama takip yaprak ve meyveler gibi dokulardan sıvı ekstraksiyonu ile başlar. Biyofarmasötiklerle üretimi için, DSP maliyetleri toplam üretim maliyetlerinin 6,7 varan% 80'ini ve kısmen bu tür bıçak tabanlı homojenizasyon 8,9 olarak yıkıcı yöntemlerle hazırlanan özleri yüksek parçacık yükü hediye yansıtır . Filtre tabakalarının rasyonel seçim filtre kapasitesini artırmak ve maliyetlerinden 10,11 azaltabilir özü partikül büyüklüğü dağılımını maç olmasına rağmen, iyileşme başına saklanmalıdır parçacıkların sayısına göre belirlenen mutlak kapasite tavanı aşan aslaFiltre alanının birim açıklama elde etmek.
Daha az partiküller, filtrasyon tren, en iyi filtre yüzeyine ulaşması halinde tavan kaldırılabilir ve dağılmış parçacıklar geniş yumakları 12 oluşturmak üzere toplanmasını teşvik pıhtılaştırıcı maddeler olarak bilinen polimerler ile karıştırılır, bu elde edilebilir. Böyle yumaklar daha ince ve daha pahalı derinlik filtreleri ulaşan partikül yükünü azaltmak, kaba ve daha az pahalı torba filtreler daha da yukarı muhafaza edilebilir. Polimerler onlar iyi imalat uygulamaları (GMP) ile uyumlu olmalıdır biyoilaçlar için örneğin kendi uygulamaları için uygun güvenlik profiline sahip olmalı ve tipik olarak bir molar kütle> 100 kDa olmalı ve nötr ya da 13 ücret ya. Nötr pıhtılaştırma genellikle agregasyonu ve çaplarda yumakların oluşumuna neden dağılmış parçacıklar çapraz bağlama ile hareket ise 1 mm 11 yüklü polimerler, d yükünü nötralize>ispersed parçacıklar, bunların çözünürlüğünü azaltır ve dolayısıyla çökelmesine 14 neden olur.
Flokülasyon ekstresi 15,16 özelliklerini eşleştirmek için, bir tampon, pH ve iletkenlik, ve polimer türü ya da konsantrasyon olarak parametrelerini ayarlayarak geliştirilebilir. Tütün 0.5-5.0 g L-1 polietilenimin (PEI) ile ön işleme tabi özler, derin filtre kapasitesinde daha fazla 2 misli artış için 100 L'lik bir pilot ölçekli işlemde bildirilmiştir. Bu polimerin maliyeti daha az € 10 kg'lık böylece sürecin içine giriş toplu 16 başına filtreleri ve sarf malzemeleri hakkında 6.000 € maliyet tasarrufu sonuçlandı hatta daha fazla zaman selüloz bazlı filtre yardımcıları 17 ile kombine -1 olduğunu. Öyle olsa bile, öngörü modellerinin içerme 15-30 dakika 16,18 arasında tutun adımlar gerektirir çünkü depolama için daha fazla yatırım maliyetlerine yol açan, flokülant a priori ekonomik yararlarını değerlendirmek için gerekli olantanklar. Ancak, flokülasyon karmaşık doğası bu tür deneylerin sonucunu tahmin edebilirsiniz hiçbir mekanik modeller şu anda vardır. Bu makalede açıklanan nedenle, daha uygun bir tasarım-of-deneyler (DoE) yaklaşımı 19 geliştirilmiştir. Genel DoE işlemi için bir protokol en son 20 yayınlanmıştır.
Küçük ölçekli cihazları şimdi çökeltme şartları 21 yüksek verimli tarama için kullanılabilir. Reaksiyon kabı (~ 96 çukurlu bir levha üzerindeki kuyu 7 mm) ve parçacıklar veya yumakların boyutları birbirinden büyüklük sırasında daha az olabilir Ancak, bu cihazlar, gerçekçi bir bitkinin topaklaşma sırasında koşulların simüle edilmesi değil ayıklar. Bu nedenle desen ve model tahmin gücü karıştırma etkileyebilir. Ayrıca, bunun nedeni karıştırma davranışı ve çökelti sta doğrusal olmayan değişikliklere yağış içeren süreçleri küçültün zor olabilirbility 22. Bu nedenle, bu makale 100 L pilot ölçekli sürecine 16 ilk 20 ml'lik reaksiyon hacmi ölçeklenebilir sonuçlar veren, günde 50-75 numune hacmi ile tezgah üstü ölçekli tarama sistemi özetliyor. Bir DoE yaklaşımı ile kombine edildiğinde, bu öngörü modelleri kalite-by-tasarım kavramının bir parçası olarak proses optimizasyonu ve belgeler için kullanılmasına izin verir.
Aşağıda tarif edilen yöntem aynı zamanda pıhtılaştırma da maliyet tasarrufu aracı 23 olarak kabul edilmektedir hücre kültürü bazlı işlemler, üretilen biyofarmasötik adapte edilebilir. Kanola, mısır ve soya fasulyesi 24,25 üretilen β-glukuronidaz için gösterildiği gibi, aynı zamanda, bir saflaştırma stratejisinin bir parçası olarak, bir ham ekstreden hedef proteinlerin çökelmesini modellemek için de kullanılabilir. Flokülan özelliklerinin ayrıntılı bir açıklaması başka 16,26 bulunabilir ve sağlanması önemlidir polimer Concentrkus toksik olmayan ya da son ürün 11 zararlı seviyelerinin altında alınarak belirlenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
En önemli yönü parçacık topaklanmayı karakterize bir Doe kurarken tasarım prensibi örneğin pH, polimer tipi ve polimer konsantrasyonunun 16 etkisi beklenen veya olası etkileri 36,38, algılamak ve anlatmak gerekir olduğunu düşünün. Nedenle, gerçek deneyler başlamadan önce tasarım alanı (FDS) kısmını değerlendirmek önemlidir. FDS örneğin 250 bulanıklık bir fark tespit edilmesi, bilinen bir değişkenlik sistemi verilen Deney sonuçları arasındaki önc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
Materials
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
- Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
- Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
- Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
- De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
- Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
- Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
- Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
- Montgomery, D. C. . Design and Analysis of Experiments. , (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
- Rathore, A. S., Sofer, G. . Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , (2012).
- Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
- Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
- Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
- Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
- Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5’UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. . DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. . Response Surface Methods Simplified. , (2005).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. . Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , (2009).
