Procedura per valutare l'efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante

Summary

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Abstract

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Introduction

Le piante sono ampiamente utilizzati per la produzione di prodotti alimentari quali succhi di frutta, ma possono anche essere sviluppati come piattaforme per la fabbricazione di maggior valore biofarmaceutici ^1-3. In entrambi i casi, la lavorazione a valle (DSP) spesso inizia con l'estrazione di liquidi dai tessuti come foglie o frutti, seguita dalla chiarificazione di estratti di particelle cariche ^4,5. Per la fabbricazione dei prodotti biofarmaceutici, i costi di DSP possono rappresentare fino al 80% dei costi di produzione complessivi ^6,7 e ciò in parte riflette l'alta pressione di particelle presenti negli estratti preparati con metodi di disturbo come omogeneizzazione blade basato ^8,9 . Sebbene la scelta razionale di strati filtranti per abbinare la distribuzione granulometrica nell'estratto può aumentare la capacità filtrante e ridurre i costi ^10,11, il miglioramento può non superare il limite di capacità di assoluta definito dal numero di particelle che devono essere conservati perunità di superficie filtrante per ottenere chiarimenti.

Il soffitto può essere sollevato se meno particelle raggiungono la superficie dei migliori filtri nel treno filtrazione, e questo può essere raggiunto se particelle disperse sono miscelati con polimeri noti come flocculanti che promuovono l'aggregazione a formare grandi flocculi ^12. Tali fiocchi possono essere conservati più a monte da filtri a maniche grossolane e meno costosi, riducendo il carico di particelle di raggiungere il più fine e filtri di profondità più costosi. I polimeri devono avere profili di sicurezza adeguati per le loro applicazioni, ad esempio per prodotti biofarmaceutici devono essere conformi alle buone pratiche di fabbricazione (GMP), e in genere devono avere un molare di massa> 100 kDa e possono essere sia neutro o addebitato ^13. Considerando flocculanti neutri genere agiscono mediante reticolazione particelle disperse causando la loro aggregazione e la formazione dei fiocchi di diametro> 1 mm ^11, polimeri applicati neutralizzare la carica di dparticelle ispersed, riducendo la loro solubilità e provocando così la precipitazione ^14.

Flocculazione può essere migliorata regolando parametri quali tampone di pH o conducibilità, e il tipo di polimero o di concentrazione, in base alle proprietà dell'estratto ^15,16. Per gli estratti di tabacco pretrattati con 0,5-5,0 g L ^-1 polietilenimmina (PEI), un incremento maggiore di 2 volte della capacità di filtro di profondità è stato segnalato in un processo su scala pilota 100-L. Il costo di questo polimero è inferiore a 10 kg ^-1 così la sua introduzione nel processo portato a risparmi di costo di circa € 6.000 per filtri e materiali di consumo per lotto ¹⁶ o anche di più se combinato con filtro a base di cellulosa aiuti ^17. Anche così, modelli predittivi sono necessari per valutare i benefici economici a priori flocculanti perché la loro inclusione può richiedere fasi di attesa di 15-30 min ^16,18, con conseguente ulteriore costi di investimento per lo stoccaggiocarri armati. Tuttavia, attualmente non esistono modelli meccanicistici disponibili che possono predire l'esito di tali esperimenti a causa della natura complessa di flocculazione. Pertanto, un approccio ¹⁹ esperimenti progettazione di-più appropriati (DoE) è stato sviluppato come descritto in questo articolo. Un protocollo per la procedura generale DoE è stato recentemente pubblicato ^20.

Dispositivi di piccole dimensioni sono ora disponibili per l'high-throughput screening di condizioni di flocculazione ^21. Tuttavia, questi dispositivi non possono realisticamente simulare le condizioni durante la flocculazione di estratti vegetali perché le dimensioni del recipiente di reazione (~ 7 mm per pozzetti su una piastra a 96 pozzetti) e le particelle o fiocchi possono essere inferiore ad un ordine di grandezza a parte. Questo può influenzare i modelli e quindi il potere predittivo del modello di miscelazione. Inoltre, può essere difficile per scalare i processi che coinvolgono precipitazioni dovute a variazioni non lineari nel comportamento di miscelazione e precipitato stabilità ^22. Pertanto, questo articolo illustra un sistema di screening banco scala con una portata di 50-75 campioni al giorno, producendo risultati che sono scalabile dal volume iniziale reazione 20 ml ad un processo su scala pilota 100 L ^16. Quando combinato con un approccio DoE, questo permette ai modelli predittivi da utilizzare per l'ottimizzazione del processo e la documentazione come parte di un concetto di qualità by design.

Il metodo descritto di seguito può anche essere adattato alle biofarmaceutici prodotte nei processi basati su colture cellulari, in cui flocculanti sono anche essere considerato come uno strumento di risparmio di costi ^23. Può anche essere usata per modellare la precipitazione delle proteine ​​target da un estratto grezzo come parte di una strategia di purificazione, come dimostrato per β-glucuronidasi prodotto in canola, soia e granoturco ^24,25. Una descrizione dettagliata delle proprietà flocculanti può essere trovato altrove ^16,26 ed è importante per garantire che il polimero Concni sono o non tossici o nocivi di sotto dei livelli nel prodotto finale ^11.

Protocol

1. Sviluppare una strategia sperimentale adeguato Identificare i parametri ambientali e di processo che sono rilevanti per la procedura di flocculazione essere stabilito o ottimizzate, vale a dire che i fattori hanno l'effetto più forte sul flocculazione. Tipicamente, ci sono parecchi tali parametri così un approccio DoE come recentemente descritti 20 è necessario a causa della mancanza di modelli meccanicistici. Selezionare i parametri (fattori) sulla base di dati di lette…

Representative Results

Flocculazione di estratto di tabacco con diversi polimeri Il metodo sopra descritto è stato usato con successo per sviluppare un processo per la flocculazione di estratti di tabacco durante la produzione di un anticorpo monoclonale (anticorpi HIV-neutralizzanti 2G12) e una proteina fluorescente (DsRed) (Figura 1) 16, e da allora è stato trasferito ad altre proteine, tra cui lectine, malaria candid…

Discussion

L'aspetto più importante da considerare quando si imposta un DoE per caratterizzare flocculazione delle particelle è che il design deve in linea di principio essere in grado di individuare e descrivere gli effetti attesi o possibili ^36,38, come ad esempio l'influenza del pH, tipo di polimero e la concentrazione di polimero ^16. Pertanto, è importante valutare la frazione di spazio di progettazione (FDS) prima di iniziare gli esperimenti reali. L'FDS è la frazione di spazio s…

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Catiofast VSH	BASF	79002360	Flocculating agent
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chitosan	Carl Roth GmbH	5375.1	Flocculating agent
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K700P 60D	Pall	5302305	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Polymin P	BASF	79002360	Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Homogenization device with custom blade tool
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement