The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
Растения широко используются для производства продовольственных товаров , таких как фруктовые соки, но они также могут быть разработаны в качестве платформы для производства более ценных продуктов биофармацевтических 1-3. В обоих случаях, вниз по течению обработки (DSP) часто начинается с извлечения жидкости из тканей , таких как листья или плоды, а затем разъяснении частиц нагруженные экстрактов 4,5. Для изготовления биофармацевтических, стоимость DSP может составлять до 80% от общих расходов 6,7 производства , и это отчасти отражает высокий частиц шихты , присутствующий в экстрактах , полученных с помощью подрывных методов , таких как лезвия на основе усреднении 8,9 , Несмотря на то, рациональный отбор фильтрующих слоев в соответствии с распределением частиц по размерам в экстракте может увеличить пропускную способность фильтра и снизить затраты 10,11, улучшение никогда не может превышать потолок абсолютной мощности , определенной по числу частиц , которые должны быть сохранены вединица площади фильтра для достижения разъяснения.
Потолок может быть поднята , если меньше частиц достигают поверхности лучших фильтров в фильтрационной поезде, и это может быть достигнуто , если диспергированные частицы смешивают с полимерами , известными в качестве флокулянтов , которые способствуют агрегации с образованием больших хлопьев 12. Такие Хлопья могут быть сохранены дальше вверх по течению от более грубых и менее дорогие фильтры мешка, уменьшая нагрузку частиц, достигающего тоньше и более дорогие глубины фильтров. Полимеры должны иметь профили безопасности , подходящие для их применения, например , для биофармацевтических они должны быть совместимы с надлежащей производственной практики (GMP), и , как правило , они должны иметь молекулярную массу> 100 кДа и может либо быть нейтральным или заряженный 13. В то время как нейтральные флокулянты в общем действуют сшивкой дисперсные частицы , что приводит к их агрегации и образование флокул диаметром> 1 мм 11, заряженные полимеры нейтрализуют заряд Dispersed частицы, уменьшая их растворимость и , таким образом , вызывая осаждение 14.
Флокуляции может быть улучшена за счет регулировки таких параметров, как буфера рН или проводимость, а также от типа полимера или концентрации, чтобы соответствовать свойствам экстракта 15,16. Что касается табачных экстрактов , предварительно обработанных с 0,5-5,0 г L -1 полиэтиленимина (PEI), большее , чем 2-кратное увеличение емкости глубинного фильтра сообщалось в процессе опытно-промышленные 100-L. Стоимость этого полимера меньше , чем € 10 кг -1 поэтому его введение в процесс привело к экономии около € 6000 для фильтров и расходных материалов на партию 16 или даже больше , когда в сочетании с целлюлозой на основе фильтрующих средств 17. Тем не менее , прогностические модели должны оценивать априорных экономические выгоды от флокулянтов , потому что их включение может потребовать шаги трюме 15-30 мин 16,18, в результате дальнейших инвестиционных затрат на хранениетанки. Тем не менее, в настоящее время нет механистические модели доступны, которые могут предсказать исход таких экспериментов из-за сложного характера флокуляции. Таким образом, подход 19 более соответствующие эксперименты дизайн-оф-(DOE) был разработан , как описано в этой статье. Протокол общей процедуре МЭ Недавно были опубликованы 20.
Небольшие устройства теперь доступны для высокопроизводительного скрининга условий флокуляции 21. Тем не менее, эти устройства не могут реально имитировать условия во время флокуляции экстрактов растений, так как размеры реакционного сосуда (~ 7 мм для лунок на 96-луночный планшет) и частиц или хлопьев может быть меньше, чем на порядок друг от друга. Это может повлиять на смешивание модели и, следовательно, предсказательная сила модели. Кроме того, это может быть трудно сократить масштабы процессов с участием осадков из-за нелинейных изменений в поведении и смешивания осадка ГНА22 ность. Поэтому в данной статье излагается стендовая масштабную систему скрининга с пропускной способностью 50-75 образцов в день, что дает результаты, которые масштабируются от исходного 20 мл реакционного объема в процессе 16 опытно-промышленные 100 л. В сочетании с подходом DOE, это позволяет прогностические модели, которые будут использоваться для оптимизации процесса и документации в рамках концепции качества по-дизайну.
Метод , описанный ниже , может также быть адаптирован к биофармацевтических , производимых в процессе культивирования клеток на основе, где флокулянт также рассматриваются в качестве инструмента 23 экономии. Он также может быть использован для моделирования осаждения белков – мишеней из неочищенного экстракта в качестве составной части стратегии очистки, как показано на бета-глюкуронидазы , полученного в канолы, кукурузы и сои 24,25. Подробное описание флокулянтов свойств можно найти в других 16,26 и важно , чтобы гарантировать , что полимер концентрations либо нетоксичный или ниже вредных уровней в конечном продукте 11.
Самый важный аспект необходимо учитывать при создании DoE для характеристики флокуляции частиц является то , что конструкция в принципе должна быть в состоянии обнаружить и описать предполагаемые или возможные эффекты 36,38, например , влияние рН, типа полимера и концентрации <s…
The authors have nothing to disclose.
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |