Förfarande för att utvärdera effektiviteten av flockningsmedel för att avlägsna dispergerade partiklarna från växtextrakt

Summary

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Abstract

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Introduction

Växter är allmänt används för att producera livsmedelsråvaror såsom fruktjuicer, men de kan också utvecklas som plattformar för tillverkning av högre värde biofarmaceutiska produkter ^1-3. I båda fallen, nedströms (DSP) börjar ofta med extraktion av vätskor från vävnader såsom blad eller frukter, följt av klargörande av partikelbemängd extrakt ^4,5. För tillverkning av biologiska läkemedel, kan kostnaderna för DSP står för upp till 80% av de totala produktionskostnaderna ^6,7 och detta delvis återspeglar den höga partikelbördan närvarande i extrakt framställda av störande metoder såsom bladbaserade homogenisering ^8,9 . Även rationell urval av filterskikt för att matcha partikelstorleksfördelningen i extraktet kan öka filterkapacitet och minska kostnaderna ^10,11, kan förbättringen aldrig överstiga ett tak på absoluta kapacitet definieras av antalet partiklar som måste bevaras perenhet av filterytan för att uppnå förtydligande.

Taket kan lyftas om färre partiklar når ytan av de finaste filter i filtrerings tåg, och detta kan uppnås om spridda partiklar blandas med polymerer som är kända som flockningsmedel som främjar aggregering att bilda stora flockar ^12. Sådana flockar kan behållas längre uppströms av grövre och billigare påsfilter, vilket minskar partikelbördan når finare och dyrare djupfilter. Polymer måste ha säkerhetsprofiler som är lämpliga för sina ansökningar, till exempel för bioläkemedel de måste vara kompatibel med god tillverkningssed (GMP), och typiskt måste ha en molmassa> 100 kDa och kan antingen vara neutral eller debiteras ^13. Medan neutrala flockuleringsmedel fungerar däremot i allmänhet genom tvärbindning dispergerade partiklarna orsakar deras aggregering och bildandet av flockar med diametrar> 1 mm ^11, laddade polymerer neutralisera laddningen av dispersed partiklar, vilket minskar deras löslighet och därmed orsakar utfällning ^14.

Flockning kan förbättras genom att justera parametrar såsom pH eller konduktivitet, och typen polymer eller koncentration, för att matcha egenskaperna hos extraktet ^15,16. För tobaksextrakt förbehandlats med 0,5-5,0 g L ^-1 polyetylenimin (PEI), en mer än två-faldig ökning av djupfilter kapacitet rapporterades i en 100-L pilotskala process. Kostnaden för denna polymer är mindre än € ​​10 kg ^-1 så dess införande i processen resulterat i kostnadsbesparingar på cirka 6000 € för filter och förbrukningsartiklar per sats ¹⁶ eller ännu mer när de kombineras med cellulosabaserat filterhjälpmedel ^17. Trots detta är prediktiva modeller som krävs för att utvärdera a priori ekonomiska fördelarna med flockningsmedel eftersom deras integration kan kräva håll stegen 15-30 min ^16,18, vilket resulterar i ytterligare investeringskostnader för lagringtankar. Men det finns för närvarande inga mekanistiska modeller som kan förutsäga resultatet av dessa experiment på grund av den komplicerade karaktären av flockning. Därför var en mer lämplig utformning-of-experiment (DOE) metod ¹⁹ utvecklats som beskrivs i denna artikel. Ett protokoll för den allmänna DoE förfarande har nyligen publicerats ^20.

Små produkter finns nu tillgängliga för high-throughput screening av flockningsförhållanden ^21. Dock kan dessa enheter inte realistiskt simulera förhållanden under flockning av växtextrakt, eftersom dimensionerna hos reaktionskärlet (~ 7 mm för brunnar på en 96-brunnar) och partiklar eller flockar kan vara mindre än en storleksordning isär. Detta kan påverka blanda mönster och därmed prognosförmåga av modellen. Dessutom kan det vara svårt att skala ner processer som involverar utfällning på grund av icke-linjära förändringar i blandnings beteende och fällning staheten ^22. Därför denna artikel beskriver en bänk-top-skala screeningsystem med en kapacitet på 50-75 prover per dag, ger resultat som är skalbara från den ursprungliga 20 ml reaktionsvolym till en 100 L pilotskala process ^16. När de kombineras med en DoE tillvägagångssätt, ger detta de prediktiva modeller som ska användas för processoptimering och dokumentation som en del av en kvalitet-för-designkoncept.

Metoden som beskrivs nedan kan också anpassas till biologiska läkemedel som produceras i cellkultur-baserade processer, där flockningsmedel är också betraktas som en kostnadsbesparande verktyg ^23. Den kan också användas för att modellera den utfällning av målproteiner från ett råextrakt som en del av en strategi för rening, såsom visats för β-glukuronidas som produceras i raps, majs och sojaböna ^24,25. Kan hittas En detaljerad beskrivning av flockningsegenskaper på andra ställen ^16,26 och det är viktigt att säkerställa att polymer concentrheten är antingen icke-toxiska eller under skadliga nivåer i slutprodukten ^11.

Protocol

1. Utveckla en tillräcklig experimentell strategi Identifiera de miljömässiga och processparametrar som är relevanta för flockningsförfarande som skall upprättas eller optimeras, dvs vilka faktorer har den starkaste effekten på flockning. Vanligtvis finns det flera sådana parametrar så ett DOE tillvägagångssätt som nyligen beskrivits 20 är nödvändig på grund av bristen på mekanistiska modeller. Välj parametrar (faktorer) baserat på litteraturdata 12,…

Representative Results

Flockning av tobaksextrakt med olika polymerer Den ovan beskrivna metoden användes med framgång för att utveckla ett förfarande för flockning av tobaksextrakt under tillverkningen av en monoklonal antikropp (HIV-neutraliserande antikropp 2G12) och ett fluorescerande protein (DsRed) (Figur 1) 16, och har sedan överförts till andra proteiner, inklusive lektiner, malariavaccinkandidater och fusi…

Discussion

Den viktigaste aspekten att tänka på när inrätta ett DOE att karakterisera partikelflock är att konstruktionen måste i princip kunna upptäcka och beskriva de förväntade eller möjliga effekter ^36,38, t ex påverkan av pH, polymertyp och polymerkoncentration ^16. Därför är det viktigt att utvärdera den del av design utrymme (FDS) innan den verkliga experiment. FDS är den del av den flerdimensionella experimentella utrymmet (som omfattas av konstruktionsfaktorer, t.ex. …

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Catiofast VSH	BASF	79002360	Flocculating agent
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chitosan	Carl Roth GmbH	5375.1	Flocculating agent
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K700P 60D	Pall	5302305	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Polymin P	BASF	79002360	Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Homogenization device with custom blade tool
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement