Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

تجميد البيولوجية الحفازة متعدد في الخرز الجيني للالعامل المساعد تجديد وتحسين إعادة استخدام

Published: April 22, 2016 doi: 10.3791/53944
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Chemical Engineering, Konkuk University, 2Department of Chemical Engineering, University of Michigan

Summary

قدم هو بروتوكول شارك مستوقف البيولوجية الحفازة خلية كاملة لتجديد العامل المساعد وتحسين إعادة استخدام، وذلك باستخدام إنتاج L-زايلولوز كمثال على ذلك. ويتحقق تجديد العامل المساعد من قبل اقتران سلالتين القولونية التعبير عن الانزيمات التكميلية وظيفيا. حقق المتحفز الحيوي تجميد كامل الخلية التي كتبها تغليف الخلايا في حبات الجينات الكالسيوم.

Abstract

لقد وضعت مؤخرا نظام biocatalytic خلية كاملة بسيطة، قابلة لإعادة الاستخدام وإلى جانب القدرة على تجديد العامل المساعد والشلل المتحفز الحيوي لتحسين العائد إنتاج وتركيب المستدام. طيه وصفها هو الإجراء التجريبي لتطوير مثل هذا النظام تتكون من اثنين من E. سلالات كولاي التي تعبر عن الإنزيمات التكميلية وظيفيا. معا، ويمكن لهذه الانزيمات اثنين تعمل بصورة تعاونية للتوسط في تجديد العوامل المساعدة مكلفة لتحسين المحصول المنتج من bioreaction. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن طريقة تجميع شكل يجمد النظام biocatalytic مقرونة تغليف الخلايا بأكملها في حبات الجينات الكالسيوم. وكمثال على ذلك، نقدم الحيوي محسنة من L-زايلولوز من L-arabinitol بواسطة اقتران E. خلايا القولونية التعبير عن الانزيمات L-arabinitol نازعة أو أوكسيديز NADH. تحت الظروف المثلى وباستخدام تركيز الأولي من 150ملي L-arabinitol، بلغ الأقصى-L زايلولوز العائد 96٪، وهي نسبة أعلى من تلك التي ذكرت في الأدبيات. أظهر شكل يجمد لالبيولوجية الحفازة خلية كاملة إلى جانب الاستقرار التشغيلي الجيد، والحفاظ على 65٪ من المحصول تم الحصول عليها في الدورة الأولى بعد 7 دورات إعادة استخدامها على التوالي، في حين أن النظام الخليوي حرة فقدت تماما تقريبا النشاط التحفيزي. ولذلك، فإن وسائل ذكرت هنا توفر اثنين من الاستراتيجيات التي يمكن أن تساعد على تحسين الإنتاج الصناعي من L-زايلولوز، فضلا عن غيرها من المركبات ذات القيمة المضافة التي تتطلب استخدام العوامل المساعدة بشكل عام.

Introduction

أصبح التخفيض خلية كاملة أحيائي باستخدام الكائنات الدقيقة طريقة على نطاق واسع لتركيب الكيماوي الأنزيمية من الجزيئات الحيوية الهامة تجاريا وعلاجيا 1-3. وهو يقدم العديد من المزايا على استخدام الإنزيمات المعزولة، وخاصة القضاء على عمليات تنقية المصب مكثفة من حيث التكلفة ومظاهرة من العمر الممتد 4-7. لمسارات biocatalytic حيث يطلب من العوامل المساعدة لتشكيل المنتجات والنظم خلية كاملة لديها القدرة على توفير في الموقع العامل المساعد تجديد عن طريق إضافة غير مكلفة-التبرع الإلكترون المشارك ركائز 5،8،9. ومع ذلك، تتقلص هذه القدرة على ردود الفعل التي تتطلب تركيز متكافئة النادرة أو باهظة الثمن المشارك ركائز 10-13. جنبا إلى جنب مع إعادة استخدام الفقيرة من الخلايا الكاملة، وهذا يعوق إنشاء الم Ù تحجيم ومستمرنظام ction. مطلوبة التعديلات الاستراتيجية لنظم خلية كاملة لهذه التحولات الحيوية التي تعتمد على العامل المساعد للتغلب على القيود المذكورة أعلاه. على وجه التحديد، وقد ثبت أن الجمع بين البيولوجية الحفازة خلية كاملة تعمل بشكل تعاوني ليعزز إلى حد كبير الإنتاجية وثبات إنزيمات آوى 14. هذه العوامل، التي غالبا ما تكون حاسمة لتمكين الإنتاج على نطاق واسع من المنتجات مجدية تجاريا، يمكن زيادة الأمثل كل شل حركة المشارك الميكروبات biocatalytic 15. لقد وضعت مؤخرا خلية كاملة نظام biocatalytic بسيطة وقابلة لإعادة الاستخدام التي تسمح لكل تجديد العامل المساعد والشلل المتحفز الحيوي لل-L زايلولوز إنتاج 16. في هذه الدراسة، تم استخدام هذا النظام كمثال لتوضيح الإجراءات التجريبية من تطبيق هذه الاستراتيجيات اثنين لتحسين العائد إنتاج أحيائي وإعادة استخدام المتحفز الحيوي.

L-زايلولوز ينتمي إلى القانون المدنيSS من الجزيئات المفيدة بيولوجيا يدعى السكريات نادرة. السكريات الأحادية هي نادرة فريدة من نوعها أو مشتقات السكر الذي يحدث نادرا جدا في الطبيعة، ولكن تلعب أدوارا حاسمة كعناصر الاعتراف في الجزيئات النشطة بيولوجيا 17،18. لديهم مجموعة متنوعة من التطبيقات بدءا من المحليات، والأغذية الوظيفية إلى العلاجات المحتملة 19. L-زايلولوز يمكن استخدامها كمانع المحتمل لعدة α-غلوكوسيديزات، ويمكن أيضا أن تستخدم كمؤشر على التهاب الكبد أو الكبد تليف الكبد 17،20. تم الإبلاغ عن تحويل كفاءة عالية من إكسيليتول إلى L-زايلولوز في أنظمة خلية كاملة سابقا في Pantoea ananatis 21،22، المقلونة ليرة سورية. 701B 23، عصيات الشاحبة Y25 24،25 والقولونية 26. في E. القولونية، ومع ذلك، لم يتحقق إلا باستخدام منخفضة (<67 مم) تركيزات إكسيليتول 26 بسبب الآثار المثبطة المحتملة لتركيز إكسيليتول الأولي أعلى من 100 ملم على النشاط إكسيليتول-4-نازعة 21،26. وقد تبين التوازن الحرارية بين زايلولوز وإكسيليتول لصالح بشدة تشكيل إكسيليتول 25،27. بالإضافة إلى ذلك، العائد زايلولوز محدودة بمقدار العوامل المساعدة باهظة الثمن التي لا بد من توفيرها في ظل عدم وجود نظام في الموقع العامل المساعد تجديد. معا، هذه العوامل تحد من إمكانية التوسع في نظم مستدامة لالحيوي-L زايلولوز.

للتغلب على هذه القيود وتحسين العائد أحيائي-L زايلولوز، كان يعمل استراتيجية تجديد العامل المساعد أول من وضع نظام biocatalytic خلية كاملة إلى جانب. على وجه التحديد، L-Arabinitol 4 نازعة (EC 1.1.1.12) من فطر المستلحمة jecorina (HjLAD)، وهو الانزيم في مسار-L الارابينوز تقويضي من الفطريات تم اختيار، لتحفيز تحويل L-arabinitol إلى L-زايلولوز 28،29 . مثل العديد من الإنزيمات السكروز، وهو limitatio كبيرن من HjLAD هو أنه يتطلب كمية متكافئة من تكلفة نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد العامل المساعد (NAD +، وشكل المؤكسد من NADH) لتنفيذ هذا التحويل. وقد تبين NADH أوكسيديز وجدت في العقدية المقيحة (SpNox) لعرض النشاط المرتفع العامل المساعد-تجديد 30،31. الاستفادة من هذه السمة من SpNox، E. اقترنت خلايا القولونية التعبير عن HjLAD لإنتاج L-زايلولوز مع E. خلايا القولونية التعبير عن SpNox للتجديد من NAD + إلى زيادة إنتاج-L زايلولوز يصور رد فعل يقترن هو مبين في الشكل 1A. تحت الظروف المثلى وباستخدام تركيز الأولي من 150 ملي L-arabinitol، بلغ الأقصى-L زايلولوز العائد 96٪، مما يجعل هذا النظام أكثر كفاءة بكثير من تلك التي ذكرت في الأدب.

كان يعمل استراتيجية تجميد خلية كاملة بجانب زيادة تعزيز إعادة استخدام من جانب biocatalytنظام جيم. وتشمل الأساليب المستخدمة عادة لتجميد كامل الخلية الامتزاز / التساهمية ربط المصفوفات الصلبة، عبر ربط / انحباس والتغليف في شبكات البوليمرية (32). ومن بين هذه الأساليب، الأسلوب الأكثر مناسبة لتجميد الخلية التغليف في حبات الجينات الكالسيوم. خصائصها دبق خفيفة، مصفوفة المائية الخاملة والمسامية العالية تساعد في الحفاظ على الخصائص الفسيولوجية وظائف البيولوجية مغلفة 33. ولذلك، فإن نظام المتحفز الحيوي إلى جانب تحتوي على كل من E. وقد ثبتوا الخلايا القولونية إيواء HjLAD أو SpNox في حبات الجينات الكالسيوم لتمكين دورات متعددة من الإنتاج L زايلولوز (الشكل 2). وأظهر نظام المتحفز الحيوي يجمد الاستقرار التشغيلي الجيد، والحفاظ على 65٪ من العائد تحويل الدورة الأولى بعد 7 دورات إعادة استخدامها على التوالي، في حين أن النظام الخليوي حرة فقدت تماما تقريبا النشاط التحفيزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. كامل الخلية البيولوجية الحفازة التحضير

ملاحظة: المؤتلف E. خلايا القولونية إيواء pET28a- SpNox 31 أو pET28a- HjLAD 28 والمشار إليها فيما E. القولونية E. SpNox و القولونية HjLAD، على التوالي.

  1. تلقيح مستعمرة واحدة من E. القولونية HjLAD في 3 مل من المتوسط ​​تستكمل مع كانامايسين (50 ميكروغرام / مل) لوريا، Bertani (LB)، واحتضان في حاضنة يا شاكر / N عند 37 درجة مئوية، 250 دورة في الدقيقة.
  2. تمييع الثقافة بنسبة 1: 100 في 200 مل من LB الطازجة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين واحتضان عند 37 درجة مئوية، 250 دورة في الدقيقة حتى OD 600 تصل إلى ~ 0.6.
  3. حمل بروتين تعبير HjLAD بإضافة 0.1 ملي الآيزوبروبيل β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى مستنبت واحتضان عند 16 درجة مئوية، 180 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة.
    1. بدلا من ذلك، نفذ الحث على 25 درجة مئوية، و 200 روبيةيتم تنفيذ م لمدة 6 ساعة إذا الحيوي-L زايلولوز (الخطوة 2 أدناه) في نفس اليوم.
  4. حصاد E. يسببها خلايا القولونية HjLAD بواسطة الطرد المركزي في 3200 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل طاف، والشروع في الخطوة 2 لمعالجة بيليه الخلية.
  5. في موازاة ذلك، نفذ الخطوات 1،1-1،4 لE. القولونية SpNox.

2. البناء الحيوي من L-زايلولوز بواسطة اقتران E. القولونية E. HjLAD و القولونية SpNox عن العامل المساعد التجديد

  1. Resuspend والكريات خلية من E. القولونية E. HjLAD و القولونية SpNox بشكل منفصل في 50 العازلة ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) في مناطق ذات كثافة خلية من 5.0 ز الخلايا الجافة الوزن (gDCW) / L.
    ملاحظة: يمكن إنشاء ارتباط بين gDCW والكثافة الضوئية تقاس في 600 نانومتر (OD 600) لتسهيل التجربة. الصيغة المستخدمة فيهذا البروتوكول هو 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600-،0965، والتي يمكن أن تختلف بين الطيف المختلفة.
  2. مزيج 600 ميكرولتر من 5.0 gDCW / L E. القولونية HjLAD، 600 ميكرولتر من 5.0 gDCW / L E. القولونية SpNox، و 100 ميكرولتر من 20 ملي NAD +، و 150 ميكرولتر من 2 M L-arabinitol في 14 مل أنبوب جولة القاع وجعل حجم رد الفعل إلى 2 مل وذلك بإضافة 550 ميكرولتر من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) .
    ملاحظة: نسبة من المبلغ البيولوجية الحفازة اثنين كامل الخلية يمكن أن يكون الأمثل لتحسين الحيوي المنتج. وبالنسبة للنظام وصفها، نسبة E. القولونية SpNox: E. القولونية HjLAD = 1: 1 وجدت لتكون الأمثل ل-L زايلولوز الحيوي (الشكل 1B).
  3. احتضان خليط التفاعل في 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعة.
  4. جمع طاف بعد الطرد المركزي في 4 درجة مئوية، 3200 x ج لمدة 10 دقيقة لالثانية المضي قدما لقياس الإنتاج L زايلولوز كما هو موضح في الخطوة 3 أدناه.

3. اللونية الفحص لالكمي-L زايلولوز

  1. نضح 100 ميكرولتر من طاف رد فعل جمعها من الخطوة 2.4 في أنبوب 1.5 مل.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من 1.5٪ السيستين، 900 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 70٪، و 50 ميكرولتر من 0.1٪ carbazole يذوب في الإيثانول ومزيج بلطف بواسطة أنبوب عكس 3 مرات.
  3. احتضان خليط التفاعل في 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
  4. قياس الامتصاصية البصري للخليط التفاعل في 560 نانومتر (A 560) باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    1. تمييع خليط التفاعل إذا كانت القراءة على 560 فوق 1.

4. الشلل المؤتلف المحفزات خلية كاملة في الخرز الجيني الكالسيوم

  1. حل 4 غرام الجينات الصوديوم في 100 مل من الماء المقطر. يعد حل الجينات من خلال إضافة الصورةالكراهية الجينات على المياه لتجنب تشكيل كتل. تسخين الخليط إذا لزم الأمر.
  2. إضافة 600 ميكرولتر من 5.0 gDCW / L E. القولونية HjLAD و 600 ميكرولتر من 5.0 gDCW / L E. القولونية SpNox في 1.2 مل 4٪ الجينات أعدت في الخطوة 4.1 و مزيج من الخلايا والجينات من قبل pipetting لطيف لتجنب تشكيل فقاعة.
  3. نضح تعليق الجينات / الخلية إلى حقنة باستخدام إبرة ويضاف خليط قطرة من الحكمة في كلوريد 0.3 M الكالسيوم (CaCl 2) حل في كوب 100 مل مع التقليب المستمر.
    ملاحظة: حجم CaCl 2 الحل تستخدم لتشكيل حبة الجينات ينبغي أن يكون كافيا لقطرات الجينات لتكون مغمورة تماما. بالإضافة إلى ذلك، يجب المحافظة على المسافة بين إبرة حقنة وسطح محلول كلوريد الكالسيوم ضمن نطاق الأمثل لضمان تشكيل حبات كروية موحد. في نطاق مسافة الأمثل يمكن تحديد التجربةحليف ويعتمد على القطر الداخلي للإبرة. كما تقدير، تم العثور على مسافة ~ 15 ± 5 سم ليكون الأمثل ل0.6 سم (القطر الداخلي) إبرة حقنة.
  4. ترك حبات في حل CaCl 2 ل2-3 ساعة على RT دون اثارة للسماح تشكيل يشابك وهلام الخرز.
  5. صب حل CaCl 2 من دون إزعاج الخرز بصب بعناية حل CaCl 2 في أنبوب مخروطي 50 مل، ونقل حبات المتبقية في CaCl 2 الحل في 50 مل أنبوب مخروطي آخر.
  6. تغسل حبات مع 10 مل من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) المخزن المؤقت ثلاث مرات لإزالة الخلايا الزائدة CaCl 2 والامم المتحدة ومغلفة.
    ملاحظة: في أي خطوة معينة، لا أجهزة الطرد المركزي حبات لأن ذلك سوف تمزق لهم. لفصل حبات من حل، والسماح للتعليق على الوقوف دون عائق ل3-5 دقيقة. سوف حبات يستقر في القاع وغسل العازلة يمكن مصبوبفي وعاء آخر.
    1. لا تجاهل غسل العازلة المستخدمة. تجمع المخزن المؤقت المستخدم تريس، حمض الهيدروكلوريك غسل (30 مل) مع CaCl 2 حل المستعملة التي تم جمعها من الخطوة 4.5.
  7. بيليه-يجمد الامم المتحدة E. خلايا القولونية بواسطة الطرد المركزي من CaCl 2 و تريس، حمض الهيدروكلوريك حل المجمعة التي تم جمعها من الخطوة 4.6 في 3200 x ج لمدة 20 دقيقة. لتحديد كفاءة الشلل، وحساب كثافة الخلايا من الامم المتحدة ومغلفة مكعبات في gDCW / L كما هو موضح في الخطوة 2.1.
  8. نقل حبات غسلها من الخطوة 4.6 في أنبوب. اتبع الخطوات 2،2-3،4 لتقييم الحيوي-L زايلولوز باستخدام كل من الخرز غسلها في مكان الكريات الخلية.

5. الاستقرار الفحص من يجمد البيولوجية الحفازة للإنتاج-L زايلولوز

  1. جمع حبات من الخطوة 4.8 ويغسل مرتين مع 10 مل من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) عازلة دون الطرد المركزي (كما هو موضح في الخطوة 4.6).
  2. استخدام كلمن الخرز غسلها لأداء رد الفعل كما هو موضح في الخطوات 2،2-3،4.
  3. كرر الخطوات من 5،1-5،2 عن العدد المرغوب فيه من دورات الإنتاج وقياس كمية L-زايلولوز المنتجة في طاف رد فعل في كل دورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتمكين تجديد العامل المساعد، وجرى تركيب-L زايلولوز في نظام biocatalytic خلية كاملة إلى جانب تحتوي على E. القولونية E. HjLAD و خلايا القولونية SpNox. بعد الأمثل لمختلف المعلمات، وتحسين إعادة استخدام هذا النظام عن طريق شل حركة في حبات الجينات الكالسيوم (الشكل 2).

الإنتاج L-زايلولوز مع العامل المساعد التجديد عن طريق اقتران E. القولونية E. HjLAD و خلايا القولونية SpNox.
لتعزيز التحويل البيولوجي من L-arabinitol إلى L-زايلولوز، وE. القولونية E. HjLAD و اقترنت خلايا القولونية SpNox لتمكينتجديد العامل المساعد. لحساب الفروق في التعبير البروتين وتوافر العامل المساعد في E. القولونية E. SpNox و القولونية HjLAD الخلايا، دراسة مقارنة بين العائد-L زايلولوز في مختلف E. القولونية E. SpNox -to- تم إجراء نسب القولونية HjLAD. كما هو مبين في الشكل 1B، ارتفع العائد مثل E. القولونية E. SpNox -to- ارتفعت القولونية HjLAD النسبة من 0.13: 1 إلى 1: 1. كانت 1 أي ما يعادل والقصوى لهذا النظام إلى جانب: الغلة التي تم الحصول عليها عن نسب 1: 1 و 1.33. أجريت جميع التجارب أخرى مع E. القولونية E. SpNox -to- نسبة القولونية HjLAD من 1: 1. بدءا من التركيز الأولي من 150 ملي L-arabinitol، واستخدام E. القولونية HjLAD المتحفز الحيوي تنتج وحدها 118 ملي L-زايلولوز بعد 8 ساعات (نقطة التشبعلتركيز L-زايلولوز)، وهو ما يمثل العائد من 79٪ (الشكل 1C). في المقارنة، فإن استخدام E. القولونية E. HjLAD و أنتجت نسبة 1 144 ملي L-زايلولوز، وتحسين العائد إلى 96٪: خلايا القولونية SpNox في 1.

تعظيم الاستفادة من خلية كاملة المتحفز الحيوي الشلل
تجميد البيولوجية الحفازة في حبات الجينات الكالسيوم يقدم العديد من المزايا، مثل تحسين قدرتها على البقاء، نتيجة للبيئة هلام الخفيفة التي تحمي الخلايا من الضغوط المادية في مفاعل حيوي. يتم تحديد خصائص هذه الخرز الجينات إلى حد كبير من قبل المعلمات صياغة ومعالجة 34. لتحسين العائد إنتاج L-زايلولوز عن طريق شكل يجمد من المتحفز الحيوي خلية كاملة إلى جانب المذكورة أعلاه، معلمتين رئيسية، وهي الصوديوم تركيز الجينات وتركيز CaCl 2، وتقييمها. هؤلاء همالمعالم الرئيسية التي تحدد سلامة وصلابة من الخرز الجينات الكالسيوم، والتي بدورها تؤثر على كفاءة المتحفز الحيوي تجميد والانتشار الجزيئي.

كما هو مبين في الشكل 3A، أظهرت كفاءة المتحفز الحيوي تجميد اتجاه متزايد مع زيادة تركيز الجينات الصوديوم في حدود 1-3٪ (ث / ت). عندما كان تركيز الجينات الصوديوم المستخدم في المصفوفة تجميد أقل من 1٪، وكانت حبات الناتجة هشة وكسر بسهولة نظرا لاستقرار الميكانيكية منخفضة، والإفراج عن أكثر من الخلايا في المحيط CaCl 2 الحل (لا تظهر البيانات). على زيادة تركيز الجينات الصوديوم إلى أكبر من 2٪، وحبات مما أدى تصلب الرائدة مفرط للمشاكل في الانتشار الجزيئي 35 (الشكل 4). متفاوتة تركيز CaCl 2 أسفرت عن وجود اتجاه مماثل في immobilizat المتحفز الحيويكفاءة أيون. لتركيز ثابت من الجينات الصوديوم (2٪ ث / ت) وفي مجموعة من 0،1-0،4 M CaCl 2، نتج انخفاض تركيزات CaCl 2 في انخفاض صلابة من الخرز وزيادة التسرب من الخلايا في المحلول المحيط. هذا ويرجع ذلك إلى قلة توافر الكالسيوم 2+ أيونات لعبر ربط الكتل guluronate على سلاسل البوليمر الجينات 36 (الشكل 3B). ومع ذلك، زيادة تركيز CaCl 2 من 0.3 م إلى 0.4 M تحسين كفاءة المتحفز الحيوي تجميد إلا بشكل هامشي. ويرجع ذلك إلى كفاءة تجميد عالية (> 90٪)، CaCl 2 تركيزات تتجاوز 0.4 M لم تقييمها. عندما استخدمت CaCl 2 تركيزات أقل من 0.1 م، الحبرية الجينات الصوديوم التي تحتوي على المتحفز الحيوي انهارت في حل CaCl 2 و تم تشكيل أي حبات كروية (لا تظهر البيانات).

لتحقيق أقصى قدر منتم تحسين كفاءة المتحفز الحيوي تجميد دون تباطؤ كبير أسفل الانتشار الجزيئي في حبات الجينات الكالسيوم، والجينات الصوديوم وتركيز CaCl 2 التالية لتحسين الإنتاج L زايلولوز. باستخدام نفس نطاق تركيز بالنسبة للكفاءة تجميد (1-3٪ ث / ت الجينات الصوديوم و0،1-0،4 M CaCl 2) وقد لوحظ، تركيز الجينات الصوديوم الأمثل من 2٪ إلى تحقيق العائد الأقصى من الإنتاج L زايلولوز (الشكل 4A ). ما وراء هذا التركيز الأمثل، وأظهر العائد اتجاه التناقص. وكان من المتوقع هذا، وذلك بسبب المسائل في نشر المرتبطة صلابة المفرطة من الخرز الجينات الكالسيوم. وبالمثل، تم العثور على تركيز الأمثل CaCl 2 لتكون 0.3 م (الشكل 4B). جنبا إلى جنب مع البيانات الواردة في الشكل 3، وتركيز الأمثل الجينات الصوديوم (2٪) وCaCl 2 تركيز (0.3 M) التي سمحت لتشكيل الخرز معتأسست صلابة مناسبة والنفاذية، مما يتيح تسرب خلية الحد الأدنى والحد الأقصى العائد الإنتاج L زايلولوز.

وتجدر الإشارة إلى أن، هناك عامل آخر يؤثر على كفاءة الحفازة العامة للالمتحفز الحيوي يجمد هو وزن ثقافة خلية مغلفة. يزيد كفاءة الحفازة مع زيادة اللقاح خلية تصل إلى الوزن اللقاح الأمثل، والتي تتجاوز ذلك يدل على الاتجاه نحو الانخفاض 37. وثمة تفسير محتمل لهذا الانخفاض هو الاكتظاظ الخلوي، مما يعوق الانتشار الجزيئي في جميع أنحاء حبات الجينات الكالسيوم ويقلل من كفاءة الحفاز للنظام. باستخدام حالة الشلل الأمثل أعلاه، تم الحصول على أعلى إنتاج L-زايلولوز مع تحميل خلية 3.75 (gDCW) / L 16 (لا تظهر البيانات).

إعادة استخدام والبيولوجية الحفازة خلية كاملة مشلول ومجانية لL-زايلولوز الإنتاج.
باستخدام الشرط الأمثل أنشئت من 1: 1 E. القولونية E. SpNox ل نسبة القولونية HjLAD، 2٪ (ث / ت) الجينات الصوديوم، و 0.3 M CaCl 2، وثبتوا جانب انتاج خلية كاملة المتحفز الحيوي على الحد الأقصى-L زايلولوز العائد من 64٪، مقارنة مع عائدات أعلى بكثير من 96٪ للمجانا إلى جانب نظام خلية كاملة (دورة 1 من الشكل 5). لاحظ أن محصول E. يجمد كان خلية كولاي HjLAD وحده فقط 32.5٪ (لا تظهر البيانات)، أقل من ذلك من جانب نظام يجمد فضلا عن نظام المتحفز الحيوي واحدة مجانا (79٪، الشكل 1C). وكان من المتوقع هذا التخفيض كما هو معروف تجميد لتقليل نشاط البيولوجية الحفازة، وربما يرجع ذلك إلى الركيزة القيود نشرها، ولكن تم التعويض عن ميزة تحسين إعادة استخدام والمتحفز الحيوي على تجميد. هذا التأثير على استقرار المتحفز الحيوي هويتضح من الاتجاه نحو الانخفاض في العائد-L زايلولوز لوحظ على إخضاع أنظمة حرة ويجمد مرارا وتكرارا لعملية رد فعل دفعة، كما هو موضح في الشكل (5). وأظهر العائد للنظام حر انخفاض حاد بكثير من النظام يجمد، مما يدل على مزيد من فقدان سريع من نشاط انزيم في النظام الحر. ونتيجة لذلك، كان كلا النظامين ل-L زايلولوز العائد مقارنة لدورة الإنتاج 2. في نهاية 7 دورات إعادة استخدامها على التوالي، حافظت البيولوجية الحفازة مغلفة استقرارها واحتفظ 65٪ من المحصول الأصلي في حين أن خلية كاملة مجانا احتفظ نظام أقل من 10٪ من قدرتها على إنتاج L-زايلولوز. هذا يدل على أن البيولوجية الحفازة يجمد يمكن إعادة استخدامها بشكل فعال لإنتاج L-زايلولوز وأن تستفيد من تحسين إعادة استخدام والاستقرار الناجمة عن تجميد تفوق بكثير الحد من نشاط المتحفز الحيوي، الذي يمنح ميزة كبيرة لعملية الإنتاج أكثرنظام خلية كاملة مجانا.

الشكل 1
الشكل 1. جانب نظام خلية كاملة لإنتاج Biocatalytic من L-زايلولوز. (A) تخطيطي يوضح رد فعل العامل المساعد تجديد التي تحدث في نظام خلية كاملة إلى جانب تضم E. خلايا القولونية إيواء HjLAD أو SpNox، على التوالي. (ب) الاختلاف في العائد من L-زايلولوز مع مختلف E. القولونية E. SpNox ل نسب القولونية HjLAD. (C)-L زايلولوز العائد من المتحفز الحيوي خلية كاملة تتألف من الوحيد E. القولونية HjLAD مقارنة بما كان عليه نظام خلية كاملة إلى جانب تتألف من E. القولونية E. HjLAD و خلايا القولونية SpNox قادرة على تجديد العامل المساعد. المؤامرات معروضة تمثل المتوسط ​​وستاالانحراف ndard من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الشلل من البيولوجية الحفازة خلية كاملة عن طريق تغليف في الخرز الجيني. التخطيطي يمثل تشكيل الحجم بشكل موحد الكالسيوم 2+ الخرز الجينات بإضافة قطرة قطرة من تعليق الصوديوم الجينات خلية لمحلول كلوريد الكالسيوم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. معلمات المؤثرة على كفاءة الشلل من والمتحفز الحيوي خلية كاملة في الخرز الجيني. كفاءة الشلل بوصفها وظيفة من (A) الجينات الصوديوم (٪ ث / ت) 2 تركيز (ب) CaCl (M). المؤامرات المعروضة تمثل الانحراف المتوسط ​​والمعياري لثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. تقييم العائد من L-زايلولوز من مشلول جانب المتحفز الحيوي خلية كاملة بوصفها وظيفة من (A) الجينات الصوديوم (٪ ث / ت) 2 تركيز (ب) CaCl (M). المؤامرات المعروضة تمثل الانحراف المتوسط ​​والمعياري لثلاث تجارب مستقلة.نحيف "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
ويظهر الشكل 5. تقييم المتحفز الحيوي إعادة استخدام، والعائد من الإنتاج L زايلولوز لمدة 7 دورات متعاقبة من إعادة استخدام يجمد والحر إلى جانب المتحفز الحيوي خلية كاملة في الرمادي الداكن والفاتح، على التوالي. المؤامرة هو موضح تمثل الانحراف المتوسط ​​والمعياري لثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد مكنت التطورات التكنولوجية الأخيرة طفرة في تسويق biotherapeutics المؤتلف، مما أدى إلى ارتفاع تدريجي في قيمتها السوقية في صناعة التكنولوجيا الحيوية. واحدة هذا التطور هو ظهور الهندسة الأيضية في الكائنات الحية الدقيقة المؤتلف، التي أظهرت وعدا كبيرا في تأسيس النظم الصناعية قابلة لل38. كما هو الحال مع معظم عمليات، تسويق ناجحة الجزيئات الحيوية المؤتلف التي تنتجها الميكروبات المهندسة وراثيا يعتمد بشكل كبير على محصول إنتاج النظام 39. وقد أدى ذلك إلى التطور السريع في علم الوراثة "القوة الغاشمة" 39، حيث تم تنفيذه التطور الموجه من الانزيمات biocatalytic من أجل تحسين النشاط المتحفز الحيوي 3. ومع ذلك، بالنسبة لبعض المسارات الأيضية، مثل مسارات الأكسدة، مجرد تحسين المتحفز الحيوي ليست كافية للتأثير على economization الإنتاج بسبب الأثر الكبير لشركة أوراسكوم تليكوم القابضةمتطلبات رد فعل الأساسية إيه، مثل العوامل المساعدة باهظة الثمن. على نطاق والمتابعة لمثل هذا النظام، حتى مع تحسن البيولوجية الحفازة، لن يؤدي إلا إلى زيادة تكاليف الإنتاج. وبالتالي، يتعين على الطرق الاستراتيجية إضافية لتسويق bioreactions تتضمن نسبا متكافئة من العوامل المساعدة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إعادة التدوير من المتحفز الحيوي ضرورية أيضا لتحسين الجدوى الاقتصادية من العمليات الحيوية. للتغلب على أثر الحد من استهلاك العامل المساعد السريع وضعف إعادة استخدام البيولوجية الحفازة خلية كاملة، وقد وضعنا في السابق، إلى جانب خلية كاملة نظام biocatalytic يجمد لتجديد العامل المساعد وإعادة استخدام مستقر 16. وصفها في هذه الدراسة هي الإجراءات التجريبية المطلوبة لزوجين وشارك في شل اثنين البيولوجية الحفازة خلية كاملة لتحسين العائد أحيائي وإعادة استخدام، جنبا إلى جنب مع نتائج ممثل.

وهناك عامل حاسم للنظر في اقتران biocat خلية كاملةalysts هو الحفاظ على دقة السيطرة للشروط المحددة لتحريض البروتين وتكوين المنتج biocatalytic لضمان استنساخ للنظام. وينبغي تجنب الاختلافات في معايير مختلفة مثل تحريض OD 600، الاستقراء الوقت، والتركيز IPTG لتقليل التباين دفعة إلى دفعة. بالإضافة إلى ذلك، لا بد من إعادة تقييم نسبة خلية الى خلية للالتحولات الحيوية المختلفة. لاحظ أن E. القولونية HjLAD: E. تم تحديد 1 ورد في هذه الدراسة من خلال تحسين التجريبية بدلا من معدل التكافؤ النظرية: القولونية نسبة SpNox 1. لالشلل في البيولوجية الحفازة خلية كاملة المؤتلف في حبات الجينات الكالسيوم، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة لضمان الاتساق فيما يتعلق صلابة حبة وتوزيع الخلايا. أولا، يجب أن يكون الحل الجينات من خلال إضافة ببطء الجينات الصوديوم أعدت في الماء، وليس العكس لمنع تراكمها التي شاركت يونيتبول تؤثر على تركيز الجينات المحلي، وبالتالي مدى عبر ربط. ثانيا، ينبغي استخدام pipetting لطيف عند التعامل مع الخلية تعليق الجينات لتجنب تشكيل فقاعات الهواء التي تسبب إجهاد القص على الخلايا مغلفة، تعرقل نقل الجماعي الفعال وحتى يمكن أن يسبب حبات لتعويم. في حال قدم فقاعات الهواء إلى تعليق، والسماح للتعليق الخلية الجينات على الوقوف دون عائق ل20 - 30 دقيقة للسماح للفقاعات الهروب. ثالثا، عندما جعل الخرز، يجب إضافة تعليق الخلية الجينات ببطء وبعناية بطريقة الإفلات من الحكمة في حجم كاف من محلول كلوريد الكالسيوم لحجم موحد والتشكل. والخرز المغمورة غير كامل في كلوريد الكالسيوم لديهم شكل غير منتظم والفقيرة الصلابة التي يمكن أن تسهم في تسرب الخلية. وأخيرا، لتجنب التقلبات في حجم رد الفعل من غسل العازلة المتبقية، وحبات في الخطوة 4.8 يمكن نشف بخفة مع ورق الترشيح (لا الهواء الجاف).

وتشمل معشوقة = "jove_content"> استراتيجيات مشتركة لتجديد العامل المساعد يشارك في ثقافة خلايا إيواء الإنزيمات التكميلية وظيفيا وشارك في التعبير عن هذه الإنزيمات في نفس الخلية. النظام المذكور يعمل استراتيجية مختلفة من اقتران E. منفصل القولونية E. SpNox و مزارع الخلايا القولونية HjLAD، تقدم على التحكم بشكل أفضل في الحفاظ على نسبة المنشود بين الانزيمات اثنين. بالإضافة إلى ذلك، تتعرض الخلايا معربا عن البروتينات واحدة لضغط أقل من تلك في التعبير عن التعاون بروتينات متعددة، والتي يمكن أن تؤدي إلى انخفاض misfolding البروتين وزيادة تعبير البروتين 40،41. وهكذا، يعرض المباشر اقتران خلية كاملة القدرة على التوسط العمليات المحفزة متعددة الانزيم دون المساس بشكل كبير المحصول المنتج. استراتيجيات ومع ذلك، أنشأت مثل الاختيار الدقيق للمروجين للبكتيريا مع اختلاف قوة 42،43 والتحسينات في مواقع الربط الريبوسوم 44 يمكن أن يكون صاحب العملد للتخفيف من سيطرة محدودة على نسبة الانزيمات هدف في أنظمة ثقافة مشتركة أو شاركت في التعبير. من بين العديد من تقنيات الشلل، ويعرض التغليف مزايا متعددة لشل حركة البيولوجية الحفازة خلية كاملة على طرق بديلة مثل عبر ربط والامتصاص، والتي هي أكثر ملاءمة للأنزيمات تنقيته. تغليف الخلايا ويمكن أيضا أن يؤديها في مجموعة متنوعة من المواد الحيوية مثل أجار، الشيتوزان، اللثة، الكاراجينان، والجيلاتين والجينات 45 لتحسين إعادة استخدام والبيولوجية الحفازة. ومع ذلك، فقد أظهرت الجينات الكالسيوم التغليف لتكون النهج الأكثر فعالية فيما يتعلق كفاءة تجميد وجزيء حيوي إنتاج 46،47.

قيود رئيسي واحد باستخدام البكتيرية البيولوجية الحفازة خلية كاملة هو القدرة الحد الأدنى للتعديل بعد متعدية من البروتينات مغاير في البرية من نوع E. القولونية 48. وهذا يحد من الاستخدام الناجح للالبيولوجية الحفازة حقيقية النواة ثithin هذا النظام. بديلا للتغلب على هذا التحديد يمكن أن يكون استخدام الكائنات مثل الخميرة التي تكون مجهزة بشكل أفضل مع حقيقية النواة الماكينات آخر متعدية. الحد آخر من النظام المذكور هو ذات الصلة إلى استخدام تجميد لتحسين إعادة استخدام. الشلل هو استراتيجية مشتركة فعالة من حيث التكلفة المستخدمة للتصدي للاستقرار سوء البيولوجية الحفازة وتحسين معدل دوران من خلال تبسيط العمليات الحيوية 49-51. وتشمل المعالم الرئيسية التي تؤثر على أداء الحفاز البيولوجية الحفازة خلية كاملة مغلفة الصوديوم تركيز الجينات، CaCl تركيز 2، تحميل الخلية وحجم حبة. من المهم أن ندرك أن هذه المعايير ليست مستقلة عن بعضها البعض. على هذا النحو، تحليلا شاملا لجميع العوامل في دراسة واحدة هو مضيعة للوقت جدا، وبالتالي فمن الضروري اختيار المعلمات الأكثر أهمية من أجل التحسين. تقييم والمقدمة هنا هي آثارمعلمتين، الجينات الصوديوم وتركيز CaCl 2. على الرغم من عدم مناقشته في التفاصيل هنا، وقد أجرينا سابقا الأمثل للتحميل خلية، ويقارن بين اعتماد العائد على وزن الخلايا يجمد 16. وتشير التقارير في الأدب أن الاختلاف في حجم حبة ويمكن أيضا أن تعدل عائد الإنتاج عن طريق زيادة انزيم التغليف، وتحسين النشاط عن طريق زيادة المساحة السطحية للنظام يجمد أو عن طريق تغيير نشرها من ركائز والمنتجات نظرا لخصائص النقل المتغيرة. اعتمادا على ردود الفعل biocatalytic قيد النظر، قد تكون هناك حاجة اختيار من العوامل الحاسمة بديلة، الأمر الذي قد يؤدي إلى توليد مجموعة مختلفة من الظروف المثلى. دراسة مفصلة لتهيئة الظروف المثلى للمعلمات إضافية توفر مجالا لمزيد من التحسن في أداء النظام خلية كاملة إلى جانب.

باختصار، نحن تقرير implemen التجريبيالكساء نظام biocatalytic خلية كاملة إلى جانب ثبتوا في حبات الجينات الكالسيوم، مما يدل على إنتاج محسنة من L-زايلولوز. بالإعراب عن الانزيمات المؤتلف المختلفة التي تسهل العامل المساعد تعتمد مسارات biocatalytic أخرى، عوائد عالية من العديد من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا يمكن الحصول عليها باستخدام بروتوكول صفها هنا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام يمكن توسيعها لاستيعاب أكثر من اثنين البيولوجية الحفازة المؤتلف للوعاء واحد متعدد الانزيم الحيوي من المنتجات 52 وغيرها من التطبيقات من إنتاج biocatalytic، مثل أجهزة الاستشعار الميكروبية لالأكسجين الحيوي الممتص 53. الاستفادة من ميزة التآزر من هذا النظام، التغليف اتحادات الميكروبية التكافلية يمكن استخدامها لعدد لا يحصى من التطبيقات مثل المعالجة البيولوجية 54-56، التجهيز البيولوجي خلية كاملة للوقود الحيوي 57، وتعزيز نمو النبات عن طريق التربة ازدياد حيوي 58 و biomining لاسترداد المعادن 59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة. وتهدف الورقة إلى الإبلاغ عن منهجية مفصلة لتوليد نظام biocatalytic خلية كاملة إلى جانب ثبتوا في حبات الجينات. وقد تم الإبلاغ عن المستجدات العلمية في دراسة سابقة (16).

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل برنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث كوريا (جبهة الخلاص الوطني) بتمويل من وزارة التربية والتعليم والعلوم والتكنولوجيا (جبهة الخلاص الوطني، 2013R1A1A2012159 وجبهة الخلاص الوطني، 2013R1A1A2007561)، جامعة كونكوك، وقسم الهندسة الكيميائية وMCubed برنامج في جامعة ميشيغان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB broth  Sigma Aldrich L3022-6X1KG
Kanamycin Fisher BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-10G
Tris base Fisher BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma Aldrich N7004-1G
L-Arabinitol Sigma Aldrich A3506-10G
L-Cysteine Sigma Aldrich 168149
Sulfuric acid Sigma Aldrich 320501-500ML
Carbazole Sigma Aldrich C5132
Ethanol  Fisher BP2818-4
Sodium alginate Sigma Aldrich W201502
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich 223506-500G
Excella E24 shaker incubator New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies
Centrifuge 5810R Eppendrof
Beakers Fisher
Syringe Fisher
Needle Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance Ohaus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carballeira, J. D., et al. Microbial cells as catalysts for stereoselective red-ox reactions. Biotech Adv. 27 (6), 686-714 (2009).
  2. Sun, B., Kantzow, C., Bresch, S., Castiglione, K., Weuster-Botz, D. Multi-enzymatic one-pot reduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts. Biotechnol. Bioeng. 110 (1), 68-77 (2013).
  3. Smith, M. R., Khera, E., Wen, F. Engineering novel and improved biocatalysts by cell surface display. Ind. Eng. Chem. Res. 54 (16), 4021-4032 (2015).
  4. Wen, F., Sun, J., Zhao, H. Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1251-1260 (2009).
  5. Siedler, S., Bringer, S., Bott, M. Increased NADPH availability in Escherichia coli: improvement of the product per glucose ratio in reductive whole-cell biotransformation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 92 (5), 929-937 (2011).
  6. Kim, C. S., Seo, J. H., Kang, D. G., Cha, H. J. Engineered whole-cell biocatalyst-based detoxification and detection of neurotoxic organophosphate compounds. Biotech Adv. 32 (3), 652-662 (2014).
  7. Tufvesson, P., Lima-ramos, J., Nordblad, M., Woodley, J. M. Guidelines and cost analysis for catalyst production in biocatalytic processes. Org. Process Res. Dev. 15 (1), 266-274 (2011).
  8. Mouri, T., Michizoe, J., Ichinose, H., Kamiya, N., Goto, M. A recombinant Escherichia coli whole cell biocatalyst harboring a cytochrome P450cam monooxygenase system coupled with enzymatic cofactor regeneration. Appl Microbiol Bioechnol. 72 (3), 514-520 (2006).
  9. Xiao, Z., et al. A novel whole-cell biocatalyst with NAD+ regeneration for production of chiral chemicals. PloS one. 5 (1), e8860 (2010).
  10. Zhao, H., van der Donk, W. A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Curr. Opin. Biotechnol. 14 (6), 583-589 (2003).
  11. Thomas, S. M., Dicosimo, R., Nagarajan, V. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry. Trends Biotechnol. 20 (6), 238-242 (2002).
  12. Wang, Y., Li, L., Ma, C., Gao, C., Tao, F., Xu, P. Engineering of cofactor regeneration enhances (2S,3S)-2,3-butanediol production from diacetyl. Sci Rep. 3, 2643 (2013).
  13. Uppada, V., Bhaduri, S., Noronha, S. B. Cofactor regeneration - an important aspect of biocatalysis. Curr. Sci. India. 106 (7), 946-957 (2014).
  14. Fu, N., Peiris, P., Markham, J., Bavor, J. A novel co-culture process with Zymomonas mobilis and Pichia stipitis for efficient ethanol production on glucose/xylose mixtures. Enzyme Microb. Technol. 45 (3), 210-217 (2009).
  15. Chen, H. -Y., Guan, Y. -X., Yao, S. -J. A novel two-species whole-cell immobilization system composed of marine-derived fungi and its application in wastewater treatment. J. Chem. Technol. Biotechnol. 89 (11), 1733-1740 (2014).
  16. Gao, H., et al. Repeated production of L-xylulose by an immobilized whole-cell biocatalyst harboring L-arabinitol dehydrogenase coupled with an NAD+ regeneration system. Biochem. Eng. J. 96, 23-28 (2015).
  17. Beerens, K., Desmet, T., Soetaert, W. Enzymes for the biocatalytic production of rare sugars. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (6), 823-834 (2012).
  18. Poonperm, W., Takata, G., Izumori, K. Polyol conversion specificity of Bacillus pallidus. Biosci., Biotechnol., Biochem. 72 (1), 231-235 (2008).
  19. Leviiz, G., Zehner, L., Saunders, J., Beedle, J. Sugar substitutes: their energy values, bulk characteristics and potential health benefits. Am. J. Clin. Nutr. 62 (5), 1161S-1168S (1995).
  20. Zhang, Y. -W., Tiwari, M. K., Jeya, M., Lee, J. -K. Covalent immobilization of recombinant Rhizobium etli CFN42 xylitol dehydrogenase onto modified silica nanoparticles. Appl Microbiol Bioechnol. 90 (2), 499-507 (2011).
  21. Aarnikunnas, J. S., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Leisola, M., Nyyssölä, A. Cloning and expression of a Xylitol-4-Dehydrogenase gene from Pantoea ananatis. Appl. Environ. Microbiol. 72 (1), 368-377 (2006).
  22. Doten, R. C., Mortlock, R. P. Production of D- and L-Xylulose by mutants of Klebsiella pneumoniae and Erwinia uredovora. Appl. Environ. Microbiol. 49 (1), 158-162 (1985).
  23. Khan, A. R., Tokunaga, H., Yoshida, K., Izumori, K. Conversion of Xylitol to L-Xylulose by Alcaligenes sp. 701B-cells. J. Ferment. Bioeng. 72 (6), 488-490 (1991).
  24. Poonperm, W., Takata, G., Morimoto, K., Granström, T. B., Izumori, K. Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain of Bacillus pallidus Y25 and characterization of its relevant enzyme xylitol dehydrogenase. Enzyme Microb. Technol. 40 (5), 1206-1212 (2007).
  25. Takata, G., Poonperm, W., Morimoto, K., Izumori, K. Cloning and overexpression of the xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application to L-xylulose production. Biosci., Biotechnol., Biochem. 74 (9), 1807-1813 (2010).
  26. Usvalampi, A., Kiviharju, K., Leisola, M., Nyyssölä, A. Factors affecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36 (10), 1323-1330 (2009).
  27. Rizzi, M., Harwart, K., Bui-Thananh, N. -A., Dellweg, H. A kinetic study of the NAD+-Xylitol-Dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis. J. Ferment. Bioeng. 67 (1), 25-30 (1989).
  28. Pail, M., et al. The metabolic role and evolution of L-arabinitol 4-dehydrogenase of Hypocrea jecorina. Eur. J. Biochem. 271 (10), 1864-1872 (2004).
  29. Tiwari, M. K., et al. pH-rate profiles of L-arabinitol 4-dehydrogenase from Hypocrea jecorina and its application in L-xylulose production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24 (1), 173-176 (2014).
  30. Gao, H., et al. Role of surface residue 184 in the catalytic activity of NADH oxidase from Streptococcus pyogenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (16), 7081-7088 (2014).
  31. Gao, H., Tiwari, M. K., Kang, Y. C., Lee, J. -K. Characterization of H2O-forming NADH oxidase from Streptococcus pyogenes and its application in L-rare sugar production. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (5), 1931-1935 (2012).
  32. Roy, I., Gupta, M. N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb. Technol. 34 (1), 26-32 (2004).
  33. Gombotz, W. R., Wee, S. F. Protein release from alginate matrices. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 267-285 (1998).
  34. Smrdel, P., Bogataj, M., Mrhar, A. The influence of selected parameters on the size and shape of alginate beads prepared by ionotropic Gelation. Sci Pharm. 76 (1), 77-89 (2008).
  35. Idris, A., Wahidin, S. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem. 41 (5), 1117-1123 (2006).
  36. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 37 (1), 106-126 (2012).
  37. Chen, X. -H., Wang, X. -T., et al. Immobilization of Acetobacter sp. CCTCC M209061 for efficient asymmetric reduction of ketones and biocatalyst recycling. Microb. Cell Fact. 11 (1), 119-131 (2012).
  38. Yadav, V. G., et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: Towards a systematic practice. Metab. Eng. 14 (3), 233-241 (2012).
  39. Demain, A. L. From natural products discovery to commercialization: a success story. J Ind Microbiol Biotechnol. 33 (7), 486-495 (2006).
  40. Baneyx, F., Mujacic, M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnol. 22 (11), 1399-1408 (2004).
  41. De Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32-40 (2007).
  42. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  43. Alper, H., Fischer, C., Neviogt, E., Stephanopoulos, G. Tuning genetic control through promoter engineering. PNAS. 103 (8), 12678-12683 (2006).
  44. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat. Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
  45. Riaz, Q. U., Masud, T. Recent trends and applications of encapsulating materials for probiotic stability. Crit Rev Food Sci Nutr. 53 (3), 231-244 (2013).
  46. Hossain, G. S., Li, J., et al. One-step biosynthesis of α-keto-γ-methylthiobutyric acid from L-methionine by an Escherichia coli whole-cell biocatalyst expressing an engineered L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. PloS one. 9 (12), e114291 (2014).
  47. Bhushan, B., Pal, A., Jain, V. Improved enzyme catalytic characteristics upon glutaraldehyde cross-linking of alginate entrapped xylanase Isolated from Aspergillus flavus MTCC 9390. Enzyme Res. (218704), (2015).
  48. Chen, R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotech Adv. 30 (5), 1102-1107 (2012).
  49. Truppo, M. D., Hughes, G. Development of an improved immobilized CAL-B for the enzymatic resolution of a key intermediate to odanacatib. Org. Process Res. Dev. 15 (5), 1033-1035 (2011).
  50. Twala, B. V., Sewell, B. T., Jordaan, J. Immobilisation and characterisation of biocatalytic co-factor recycling enzymes, glucose dehydrogenase and NADH oxidase, on aldehyde functional ReSyn polymer microspheres. Enzyme Microb. Technol. 50 (6-7), 331-336 (2012).
  51. Wang, X. -T., et al. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061. J. Biotechnol. 163 (3), 292-300 (2013).
  52. Rios-Solis, L., et al. Modelling and optimisation of the one-pot, multi-enzymatic synthesis of chiral amino-alcohols based on microscale kinetic parameter determination. Chem. Eng. Sci. 122, 360-372 (2015).
  53. Wang, B., Barahona, M., Buck, M. A modular cell-based biosensor using engineered genetic logic circuits to detect and integrate multiple environmental signals. Biosens Bioelectron. 40 (1), 368-376 (2013).
  54. Saratale, R. G., Saratale, G. D., Kalyani, D. C., Chang, J. S., Govindwar, S. P. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR. Bioresour. Technol. 100 (9), 2493-2500 (2009).
  55. Malik, A. Metal bioremediation through growing cells. Environ. Int. 30 (2), 261-278 (2004).
  56. Bazot, S., Lebeau, T. Effect of immobilization of a bacterial consortium on diuron dissipation and community dynamics. Bioresour. Technol. 100 (18), 4257-4261 (2009).
  57. Brethauer, S., Studer, M. H. Consolidated bioprocessing of lignocellulose by a microbial consortium. Energy Environ Sci. 7 (4), 1446 (2014).
  58. Malusá, E., Sas-Paszt, L., Ciesielska, J. Technologies for beneficial microorganisms inocula used as biofertilizers. Sci World J. 2012 (491206), (2012).
  59. Brune, K. D., Bayer, T. S. Engineering microbial consortia to enhance biomining and bioremediation. Front Microbiol. 3 (203), (2012).

Tags

الكيمياء، العدد 110، المتحفز الحيوي خلية كاملة، خالية من الخلايا استخراج، العامل المساعد تجديد، ونظام يقترن الانزيم، وتجميد، L-زايلولوز، متعدد بروتين التآزر
تجميد البيولوجية الحفازة متعدد في الخرز الجيني للالعامل المساعد تجديد وتحسين إعادة استخدام
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, … More

Gao, H., Khera, E., Lee, J. K., Wen, F. Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability. J. Vis. Exp. (110), e53944, doi:10.3791/53944 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter