La inmovilización de Multi-biocatalizadores en perlas de alginato de cofactor de Regeneración y Reutilización mejorada

Summary

Se presenta el protocolo para biocatalizadores de células completas co-inmovilización para la regeneración de cofactor y la mejora de la reutilización, usando la producción de L-xilulosa como un ejemplo. La regeneración del cofactor se consigue mediante el acoplamiento de dos cepas de Escherichia coli que expresa las enzimas funcionalmente complementarios; la inmovilización biocatalizador de célula completa se consigue mediante encapsulación de células en perlas de alginato de calcio.

Abstract

Hemos desarrollado recientemente un sistema de biocatalítica de células enteras simple, reutilizable y junto con la capacidad de regeneración de cofactor y la inmovilización biocatalizador para el rendimiento de producción mejorada y síntesis sostenida. La presente se describe el procedimiento experimental para el desarrollo de un sistema de este tipo que consta de dos E. cepas de E. coli que expresan enzimas funcionalmente complementarios. Juntas, estas dos enzimas pueden funcionar cooperativamente para mediar en la regeneración de cofactores caros para mejorar el rendimiento del producto de la biorreacción. Además, se informa del método de síntesis de una forma inmovilizada del sistema biocatalıtica acoplado por la encapsulación de células enteras en perlas de alginato de calcio. A modo de ejemplo, presentamos la biosíntesis mejorada de L-xilulosa a partir de L-arabinitol acoplando E. células de E. coli que expresan las enzimas L-arabinitol deshidrogenasa o NADH oxidasa. En condiciones óptimas y el uso de una concentración inicial de 150mM L-arabinitol, el rendimiento máximo L-xilulosa alcanzó 96%, que es superior a los reportados en la literatura. La forma inmovilizada de los biocatalizadores de células completas, junto demostró una buena estabilidad de funcionamiento, el mantenimiento de 65% de los rendimientos obtenidos en el primer ciclo después de 7 ciclos de re-uso sucesivo, mientras que el sistema libre de células perdió casi por completo la actividad catalítica. Por lo tanto, los métodos que aquí se ofrece dos estrategias que podrían ayudar a mejorar la producción industrial de L-xilulosa, así como otros compuestos de valor añadido que requieren el uso de cofactores en general.

Introduction

Biotransformación reductiva de células enteras utilizando microorganismos se ha convertido en un método generalizado para la síntesis quimio-enzimática de biomoléculas comercialmente y terapéuticamente importantes ^{1 – 3.} Presenta varias ventajas sobre el uso de enzimas aisladas, especialmente la eliminación de los procesos de purificación de aguas abajo de alto coste y la demostración de un tiempo de vida prolongado ^4-7. Para vías biocatalıticas donde se requieren cofactores para la formación de productos, los sistemas de células enteras tienen el potencial para proporcionar in situ regeneración cofactor mediante la adición de bajo costo donantes de electrones co-sustratos ^5,8,9. Sin embargo, esta capacidad se reduce para las reacciones que requieren una concentración estequiométrica de co-sustratos raros o caros ^{10 – 13.} Junto con pobre capacidad de reutilización de células enteras, esto impide el establecimiento de un produ escalable y continuosistema cción. se requieren modificaciones estratégica de los sistemas de células completas para estas biotransformaciones dependiente del cofactor para superar las limitaciones antes mencionadas. Específicamente, la combinación de los biocatalizadores de células completas que funcionan en conjunto se han mostrado para mejorar de manera significativa la productividad y la estabilidad de las enzimas albergaron ^14. Estos factores, que son a menudo críticos para permitir la producción a gran escala de productos comercialmente viables, se pueden optimizar aún más por microbios biocatalıticas co-inmovilización ^15. Hemos desarrollado recientemente un sistema de biocatalítica de células enteras simple y reutilizable que permite tanto la regeneración de cofactor y la inmovilización biocatalizador para la producción de L-xilulosa ^16. En este estudio, este sistema se utiliza como un ejemplo para ilustrar los procedimientos experimentales de la aplicación de estas dos estrategias para mejorar el rendimiento de producción de biotransformación y la reutilización biocatalizador.

L-xilulosa pertenece a una class de moléculas biológicamente útiles nombrado azúcares raros. Azúcares monosacáridos son raros o únicos derivados de azúcares que se producen muy raramente en la naturaleza, sino que desempeñan un papel crucial como elementos de reconocimiento en las moléculas bioactivas ^17,18. Tienen una gran variedad de aplicaciones que van desde los edulcorantes, alimentos funcionales para terapéuticos potenciales ^19. L-xilulosa se ​​puede utilizar como un inhibidor potencial de múltiples alfa-glucosidasas, y también puede ser utilizado como un indicador de la hepatitis o cirrosis hepática ^17,20. Alta eficiencia de conversión de xilitol a L-xilulosa en los sistemas de células enteras se ha informado anteriormente en Pantoea ananatis ^21,22, Alcaligenes sp. 701B ^23, Bacillus pálido Y25 ^24,25 y ^{26 de} Escherichia coli. En E. coli, sin embargo, sólo se alcanzó usando (<67 mM) concentraciones bajas de xilitol ²⁶ debido a los posibles efectos inhibidores de una concentración inicial de xilitol superior a 100 mM sobre la actividad xilitol ^{deshidrogenasa-4-21,26.} El equilibrio termodinámico entre xilulosa y xilitol se ha demostrado que favorecen fuertemente la formación de xilitol ^25,27. Además, el rendimiento de xilulosa está limitada por la cantidad de cofactores caros que tienen que ser suministrado en la ausencia de un sistema de regeneración de cofactor en situ. En conjunto, estos factores limitan el potencial de ampliación en los sistemas sostenibles para la biosíntesis de L-xilulosa.

Para superar estas limitaciones y mejorar el rendimiento de biotransformación-L xilulosa, se empleó la estrategia de regeneración cofactor primero mediante el establecimiento de un sistema de biocatalítica de células enteras acoplado. Específicamente, L-arabinitol 4-deshidrogenasa (EC 1.1.1.12) a partir de Hypocrea jecorina (HjLAD), una enzima en la vía catabólica-L arabinosa de hongos, fue seleccionado para catalizar la conversión de L-arabinitol en L-xilulosa ^28,29 . Al igual que muchas enzimas biosintéticas, un limitatio importanten de HjLAD es que requiere una cantidad estequiométrica de la cara dinucleótido de nicotinamida adenina cofactor (NAD ^+, la forma oxidada de NADH) para llevar a cabo esta conversión. NADH oxidasa se ​​encuentra en Streptococcus pyogenes (SpNox) se ha demostrado que mostrar una alta actividad de cofactor de regeneración ^30,31. Aprovechando este atributo de SpNox, E. células de E. coli que expresan HjLAD para la producción de L-xilulosa se ​​acoplaron con E. células de E. coli que expresan SpNox para la regeneración de NAD ⁺ para aumentar la producción de L-xilulosa representado por la reacción de acoplamiento se muestra en la Figura 1A. En condiciones óptimas y usando una concentración inicial de 150 mM de L-arabinitol, el rendimiento máximo de L-xilulosa alcanzó el 96%, por lo que este sistema mucho más eficiente que los reportados en la literatura.

La estrategia de inmovilización de células enteras se empleó junto a mejorar aún más la capacidad de reutilización de la biocatalyt acopladoEl sistema de CI. Métodos utilizados comúnmente para la inmovilización de células enteras incluyen la adsorción / unión covalente a las matrices sólidas, la reticulación / atrapamiento y encapsulación en redes poliméricas ^32. Entre estos enfoques, el método más adecuado para la inmovilización de células es la encapsulación en perlas de alginato de calcio. Sus propiedades de gelificación leves, matriz acuosa inerte y de alta porosidad ayudan a preservar las propiedades fisiológicas y la funcionalidad de los productos biológicos encapsulados ^33. Por lo tanto, el sistema de biocatalizador acoplado que contiene tanto E. células de E. coli que albergan HjLAD o SpNox se inmovilizó en perlas de alginato de calcio para permitir múltiples ciclos de producción de L-xilulosa (Figura 2) .El sistema biocatalizador inmovilizado demostró una buena estabilidad de funcionamiento, el mantenimiento de 65% del rendimiento de conversión del primer ciclo después de 7 ciclos de sucesiva reutilización, mientras que el sistema libre de células perdió casi por completo su actividad catalítica.

Protocol

1.-Preparación de células enteras biocatalizadores NOTA: La E. recombinante células de E. coli que albergan pET28a- SpNox 31 o 28 pET28a- HjLAD se denominarán en adelante como E. coli SpNox y E. coli HjLAD, respectivamente. Se inocula una sola colonia de E. coli HjLAD en 3 ml de medio Luria-Bertani (LB) complementado con kanamicina (50 mg / ml) y se incuba en un incubador …

Representative Results

Para activar la regeneración de cofactor, la síntesis de L-xilulosa se ​​llevó a cabo en un sistema de biocatalítica de células enteras acoplado que contiene E. coli HjLAD y E. células de E. coli SpNox. Después de la optimización de varios parámetros, la reutilización de este sistema se ha mejorado mediante la inmovilización en perlas de alginato de calcio (Figura 2). <p class="jove_con…

Discussion

Los recientes avances tecnológicos han permitido un aumento en la comercialización de productos bioterapéuticos recombinantes, lo que resulta en un aumento gradual de su valor de mercado en la industria de la biotecnología. Uno de estos avances es la llegada de la ingeniería metabólica de microorganismos recombinantes, que ha mostrado una gran promesa en el establecimiento de sistemas industriales escalables ^38. Al igual que con la mayoría de los procesos, la comercialización exitosa de biomoléculas …

Materials

LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus