Immobilisatie van Multi-biokatalysatoren in Alginaat Kralen voor cofactorregeneratiesysteem en verbeterde Herbruikbaarheid

Summary

Weergegeven is het protocol voor co-immobiliserende hele cellen biokatalysatoren voor cofactorregeneratiesysteem en betere herbruikbaarheid, via de productie van L-xylulose als voorbeeld. De cofactor regeneratie wordt bereikt door het koppelen van twee Escherichia coli-stammen die functionele complementariteit enzymen; de hele cellen biokatalysator immobilisatie wordt bereikt door celinkapselende in calciumalginaat parels.

Abstract

We hebben onlangs een eenvoudige, herbruikbaar en gekoppeld whole-cell biokatalytische systeem de mogelijkheid cofactorregeneratiesysteem en biokatalysator immobilisatie verbeterde productieopbrengst en aanhoudende synthese. Beschreven is hierbij de experimentele procedure voor de ontwikkeling van een dergelijk systeem bestaat uit twee E. coli-stammen die functioneel complementair zijn enzymen uit te drukken. Samen kunnen deze twee enzymen functioneren coöperatief aan de regeneratie van kostbare co-factoren bemiddelen betere productopbrengst van de bioreaction. Bovendien wordt de werkwijze voor het synthetiseren van een geïmmobiliseerde vorm van het gekoppelde biokatalytische systeem inkapselen van gehele cellen in calciumalginaat parels gerapporteerd. Als voorbeeld geven we de verbeterde biosynthese van L-xylulose van L-arabinitol door koppeling E. coli-cellen die de enzymen L-arabinitol dehydrogenase en NADH oxidase. Onder optimale omstandigheden en met een beginconcentratie van 150mM L-arabinitol, de maximale L-xylulose opbrengst bedroeg 96%, wat hoger is dan die in de literatuur. De geïmmobiliseerde vorm van de gekoppelde whole-cell biokatalysatoren aangetoond operationeel stabiel handhaven 65% van de opbrengst verkregen bij de eerste cyclus na 7 cycli van opeenvolgende hergebruik, terwijl de vrije celsysteem de katalytische activiteit bijna volledig verloren. Daarom is de hier vermelde werkwijzen levert twee strategieën die kunnen bijdragen aan de industriële productie van L-xylulose, alsmede andere verbindingen met toegevoegde waarde waarbij het gebruik van co-factoren in het algemeen.

Introduction

Reductieve hele cellen biotransformatie middels micro-organismen is uitgegroeid tot een wijdverspreide werkwijze voor de chemo-enzymatische synthese van commercieel en therapeutisch belangrijke biomoleculen ^1-3. Het biedt verschillende voordelen boven het gebruik van geïsoleerde enzymen, met name de eliminatie van dure stroomafwaartse zuiveringsprocessen en de demonstratie van een langere levensduur ^4-7. Voor biokatalytische paden indien cofactoren nodig voor productvorming, whole-cell-systemen is in situ cofactorregeneratiesysteem te voorzien via de toevoeging van goedkope elektronendonerende cosubstraten ^5,8,9. Dit is echter verminderd vermogen voor reacties die een stoichiometrische concentratie van zeldzame en dure cosubstraten ¹⁰ vereisen ^{– 13.} Samen met een slechte hergebruik van hele cellen, belemmert dit de oprichting van een schaalbare en continue productie systeem. Strategische modificaties volle-celsystemen deze cofactor-afhankelijke biotransformaties moeten de bovengenoemde beperkingen te overwinnen. Specifiek zijn de combinatie van whole-cell biokatalysatoren die samen te werken aangetoond aanzienlijke verbetering van de productiviteit en stabiliteit van de enzymen ¹⁴ herbergde. Deze factoren, die vaak kritiek voor het mogelijk maken grootschalige productie van commercieel levensvatbare producten zijn, kunnen verder worden geoptimaliseerd door co-immobiliseren biokatalytische microben ^15. We hebben onlangs een eenvoudige en herbruikbare whole-cell biokatalytische systeem dat zowel cofactorregeneratiesysteem en biokatalysator immobilisatie maakt de L-xylulose productie ^16. In deze studie werd dit systeem gebruikt als een voorbeeld voor de experimentele procedures van toepassing van deze twee strategieën voor verbeterde productieopbrengst biotransformatie en biokatalysator herbruikbaarheid illustreren.

L-xylulose behoort tot een class van biologisch bruikbare moleculen genaamd zeldzame suikers. Zeldzame suikers zijn uniek monosachariden of suiker derivaten die zeer zelden in de natuur voorkomen, maar een cruciale rol spelen als een erkenning elementen in biologisch actieve moleculen ^17,18. Ze hebben een verscheidenheid aan toepassingen, variërend van zoetstoffen, functionele voedingsmiddelen potentiële therapeutische ^19. L-xylulose kunnen worden gebruikt als een mogelijke remmer van verschillende α-glucosidases, en kunnen ook worden gebruikt als een indicator van hepatitis of levercirrose ^17,20. Hoge omzettingsefficiëntie van xylitol L-xylulose geheel-celsystemen werd voorheen in Pantoea ananatis ^21,22, Alcaligenes sp. 701B ^23, Bacillus pallidus Y25 ^24,25 en Escherichia coli ^26. In E. coli, maar het werd uitsluitend gebruik van lage (<67 mM) concentraties xylitol ²⁶ vanwege mogelijke remmende effecten van een eerste xylitol concentratie hoger dan 100 mM xylitol on-4-dehydrogenase activiteit ^21,26. Thermodynamisch evenwicht tussen xylulose en xylitol is blijkt sterk begunstigen de vorming van xylitol ^25,27. Bovendien wordt xylulose opbrengst beperkt door de hoeveelheid dure cofactoren die bij afwezigheid van een in situ cofactorregeneratiesysteem te leveren hebben. Samen vormen deze factoren beperken de mogelijkheden voor schaalvergroting in duurzame systemen voor de L-xylulose biosynthese.

Om deze beperkingen te overwinnen en het verbeteren van de L-xylulose biotransformatie opbrengst, werd de strategie van cofactorregeneratiesysteem eerste in dienst van de oprichting van een gekoppelde whole-cell biokatalytische systeem. Specifiek, L-arabinitol 4-dehydrogenase (EC 1.1.1.12) van Hypocrea jecorina (HjLAD), een enzym in de L-arabinose afbraakproduct van schimmels, werd geselecteerd om de omzetting van L-arabinitol katalyseren in L-xylulose ^28,29 . Net als veel biosynthetische enzymen, een belangrijke BEPERKIn van HjLAD is dat het een stoichiometrische hoeveelheid van het dure nicotinamide adenine dinucleotide-cofactor (NAD ^+, de geoxideerde vorm van NADH) deze omzetting uit te voeren. NADH oxidase in Streptococcus pyogenes (SpNox) is aangetoond dat hoge cofactor-activiteit regeneratie ^30,31 weergegeven. Door gebruik te maken van deze eigenschap van SpNox, E. coli-cellen die HjLAD voor de productie van L-xylulose gekoppeld met E. coli-cellen die SpNox voor de regeneratie van NAD ⁺ op de L-xylulose productie beschreven door gekoppelde reactie figuur 1A stimuleren. Onder optimale omstandigheden en met een aanvankelijke concentratie van 150 mM L-arabinitol, de maximale L-xylulose opbrengst bedroeg 96%, waardoor dit systeem veel efficiënter dan die gerapporteerd in de literatuur.

De strategie van whole-cell immobilisatie werd gebruikt naast de verdere versterking van de herbruikbaarheid van de gekoppelde biocatalytic-systeem. Algemeen gebruikte werkwijzen voor whole-cell immobilisatie omvatten adsorptie / covalente koppeling aan vaste matrices, verknoping / invangen en inkapselen in polymere netwerken ^32. Onder deze benaderingen, de meest geschikte methode voor mobiele inkapseling immobilisering in calciumalginaat parels. Hun milde geleringseigenschappen, inerte waterige matrix en hoge porositeit bijdragen aan het behoud van de fysiologische eigenschappen en functionaliteit van de ingekapselde biologicals ^33. Daarom is de combinatie biokatalysator systeem dat zowel E. coli cellen die HjLAD of SpNox geïmmobiliseerd in calciumalginaat parels meerdere cycli van L-xylulose productiewijzen (figuur 2) .De geïmmobiliseerde biokatalysator systeem aangetoond operationeel stabiel handhaven 65% van het omzettingsrendement van de eerste cyclus na 7 cycli opeenvolgende hergebruik, terwijl de vrije celsysteem de katalytische activiteit bijna volledig verloren.

Protocol

1. Whole-cell Biokatalysatoren Voorbereiding LET OP: De recombinante E. coli cellen die pET28a- SpNox 31 of pET28a- HjLAD 28 zijn hierna E. SpNox coli en E. coli HjLAD respectievelijk. Inoculeer een enkele kolonie van E. coli HjLAD in 3 ml Luria-Bertani (LB) medium aangevuld met kanamycine (50 ug / ml) en geïncubeerd in een incubator shaker O / N bij 37 ° C, 250 rpm. …

Representative Results

Om cofactor regeneratie mogelijk te maken, werd L-xylulose synthese in een gekoppelde whole-cell biokatalytische systeem dat E. uitgevoerd HjLAD coli en E. SpNox coli cellen. Na de optimalisering van verschillende parameters, de herbruikbaarheid van het systeem verbeterd door immobiliseren in calciumalginaat parels (figuur 2). …

Discussion

Recente technologische ontwikkelingen hebben een sterke stijging in de commercialisering van recombinant biotherapeutica ingeschakeld, wat resulteert in een geleidelijke stijging van hun marktwaarde in de biotechnologie-industrie. Eén zo'n vooruitgang is de komst van metabolic engineering in recombinante micro-organismen, die een grote belofte bij het ​​vaststellen schaalbare industriële systemen ³⁸ is getoond. Zoals bij de meeste processen succesvolle commercialisering van recombinant biomoleculen …

Materials

LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus