Generatie van Marked en markerless Mutanten in Model cyanobacteriën Species
Summary
Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.
Abstract
Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of ‘escape’ of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.
Introduction
Cyanobacteriën zijn een evolutionair oud en divers stam van bacteriën gevonden in bijna elke natuurlijke omgeving op aarde. In de mariene ecosystemen zijn ze bijzonder overvloedig en spelen een belangrijke rol in vele nutriëntenkringlopen, goed voor ongeveer de helft van koolstof fixatie 1, de meerderheid van stikstofbinding 2 en honderden miljoenen tonnen koolwaterstof productie 3 in de oceanen jaarlijks. Chloroplasten het organel verantwoordelijk is voor de fotosynthese in eukaryote algen en planten, zijn waarschijnlijk zijn geëvolueerd van een cyanobacterie die werd opgeslokt door een gastheer organisme 4. Cyanobacteria nuttig modelorganismen gebleken voor de studie van de fotosynthese, elektronentransport 5 en biochemische wegen, waarvan vele zijn geconserveerd in planten. Bovendien cyanobacteriën worden steeds meer gebruikt voor de productie van levensmiddelen, biobrandstoffen 6, 7 elektriciteit en industriële verbindingen 8, door hun highly efficiënte omzetting van water en CO 2 op biomassa met behulp van zonne-energie 9. Veel soorten kunnen worden gekweekt op niet-landbouwgrond met een minimum aan voedingsstoffen en zeewater, wat suggereert dat cyanobacteriën zou kunnen worden geteeld op grote schaal zonder dat de landbouwproductie. Bepaalde soorten zijn ook bronnen van natuurlijke producten, waaronder antischimmel, antibacteriële en anti-kanker verbindingen 10,11.
Het vermogen om mutanten te genereren is essentieel voor het begrijpen van cyanobacteriën fotosynthese, biochemie en fysiologie en essentieel voor de ontwikkeling van stammen voor industriële doeleinden. De meeste gepubliceerde studies genereren genetisch gemodificeerde stammen door insertie van een antibioticum resistentie cassette in de plaats van belang. Dit beperkt het aantal mutaties die in een rek kan worden ingevoerd, aangezien slechts enkele antibioticaresistentie cassettes zijn beschikbaar voor gebruik in cyanobacteriën. Stammen die genen die antibioticum resistance kan niet worden gebruikt voor industriële productie ter openbare vijvers, die waarschijnlijk de enige kosten-effectieve manier tot biobrandstoffen en andere laagwaardige producten 12 produceren. Het genereren van ongemarkeerde mutanten overwint deze beperkingen. Ongemarkeerde mutanten bevatten geen vreemd DNA, tenzij opzettelijk inbegrepen en kan meerdere malen worden gemanipuleerd. Daarom is het mogelijk om zoveel veranderingen in een stam genereren gewenst. Bovendien kunnen polaire effecten van genen stroomafwaarts van de modificatieplaats worden geminimaliseerd, waardoor nauwkeuriger modificatie van het organisme 13.
Mutante stammen, zelfmoord plasmiden met twee DNA-fragmenten identiek aan gebieden in de cyanobacteriën chromosoom flankeren het gen verwijderd genereren (aangeduid als de 5 'en 3' flankerende gebieden) eerst geconstrueerd. Twee genen worden vervolgens tussen de flankerende gebieden. Eén daarvan codeert voor een antibioticumresistentie-eiwit; de tweede codeert SacB, die produces levansucrase, een verbinding verleent gevoeligheid voor sucrose. In de eerste stap van de werkwijze, gekenmerkt mutanten waarbij sommige stammen bevattende vreemd DNA, gegenereerd. Het plasmide construct gemengd met de cyanobacteriën cellen en het DNA is natuurlijk opgenomen door het organisme. Transformanten worden geselecteerd door groei op agarplaten die het geschikte antibioticum en het mutante genotype geverifieerd door PCR. Zelfmoord plasmiden kan niet repliceren binnen de stam van belang. Daarom zal antibiotica resistente kolonies ontstaan door een recombinatiegebeurtenis waarbij het gen van interesse in het chromosoom ingevoegd. Om ongemarkeerde mutanten te genereren, wordt de gemerkte mutant vervolgens gemengd met een tweede zelfmoord plasmide dat alleen de 5 'en 3' flankerende gebieden. Indien insertie van vreemd DNA is vereist, een plasmide dat bestaat uit de 5 'en 3' flankerende gebieden met een cassette die de genen van belang ingevoegd tussen deze DNA-fragmenten, kan worden gebruikt. Selectie is via groei op agar platen met sucrose. Aangezien sucrose is dodelijk voor cellen wanneer het sacB gen product tot expressie wordt gebracht, de enige cellen die overleven zijn die waarbij een tweede recombinatiegebeurtenis heeft plaatsgevonden, waarbij de sucrose gevoeligheid gen naast het antibioticum resistentiegen, werd uit de gerecombineerde chromosoom en op het plasmide. Als gevolg van de recombinatie uitwisseling worden de flankerende gebieden en alle DNA daartussen ingevoegd in het chromosoom.
We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methoden om meerdere chromosomale mutaties in dezelfde stam van Synechocystis sp genereren. PCC6803 (hierna Synechocystis) 13,14, enkelvoudige puntmutaties te introduceren in een gen van interesse 13 en expressie van gencassettes. Terwijl de generatie van ongemarkeerde knockouts heeft voorafgaand aangetoond dat ons werk in Synechocystis 15,16, een gedetailleerde methode, geholpen dooreen visuele presentatie van de kritische stappen, is niet voor iedereen beschikbaar. We hebben ook gebruikt dezelfde methode voor het genereren van duidelijke knockouts in een ander model cyanobacterie, Synechococcus sp. PCC7002 (hierna Synechococcus). Dit protocol voorziet in een duidelijke, eenvoudige methode voor het genereren van mutanten en een snelle protocol voor het valideren en opslaan van deze stammen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen in het genereren van ongemarkeerde mutanten zijn: 1) voorzichtig plasmide ontwerp om ervoor te zorgen alleen de beoogde regio is veranderd; 2) ervoor te zorgen dat de monsters blijven axenic, vooral wanneer gekweekt op sucrose; 3) plateren getransformeerde cellen gemerkt mutant generatie aanvankelijk op BG11 agarplaten ontbreekt antibiotica, gevolgd door toevoeging van agar plus antibiotica 24 uur later; 4) het kweken gemarkeerd mutanten voor 4 volle dagen voorafgaand aan de beplating op BG11 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de Environmental Services Association Education Trust, de synthetische biologie in Cambridge Synbio fonds en het ministerie van Sociale Rechtvaardigheid en Empowerment, de regering van India, voor financiële steun.
Materials
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 mL conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 mL round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
References
- Zwirglmaier, K., et al. Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes. Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).
- Galloway, J. N., et al. Nitrogen cycles: past, present, and future. Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).
- Lea-Smith, D. J., et al. Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).
- Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. The origin of plastids. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).
- Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- McCormick, A. J., et al. Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system. Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).
- Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems. Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).
- Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. Engineering cyanobacteria to generate high-value products. Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).
- Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels. Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).
- Tan, L. T. Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery. Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).
- Volk, R. B., Furkert, F. H. Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth. Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).
- Scott, S. A., et al. Biodiesel from algae: challenges and prospects. Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity. Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).
- Lea-Smith, D. J., et al. Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities. Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).
- Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).
- Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 – Consequences for pigment biosynthesis and accumulation. J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).
- Castenholz, R. W. Culturing methods for Cyanobacteria. Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).
- Mitschke, J., et al. An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).
- Ried, J. L., Collmer, A. An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis. Gene. 57, 239-246 (1987).
- Vieira, J., Messing, J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 19, 259-268 (1982).
- Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).
- Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).
- Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002. J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).
- Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803. Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).
- Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria. Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).
- Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium. Appl Environ Microbiol. , (2015).
