Generazione di marcato e markerless Mutanti nel modello di cianobatteri Specie
Summary
Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.
Abstract
Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of ‘escape’ of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.
Introduction
I cianobatteri sono un phylum evolutivamente antica e diversificata di batteri che si trovano in quasi tutti gli ambienti naturali della Terra. Negli ecosistemi marini sono particolarmente abbondanti e svolgono un ruolo chiave in molti cicli degli elementi nutritivi, che rappresentano circa la metà di fissazione del carbonio 1, la maggior parte dell'azoto fissazione 2 e centinaia di milioni di tonnellate di produzione di idrocarburi 3 negli oceani ogni anno. Cloroplasti, l'organello responsabile per la fotosintesi delle alghe e delle piante eucariotiche, è probabile che si sono evoluti da un cianobatterio che è stato inghiottito da un organismo ospite 4. Cianobatteri sono dimostrati utili organismi modello per lo studio della fotosintesi, trasporto di elettroni 5 e percorsi biochimici, molti dei quali sono conservati nelle piante. Inoltre cianobatteri sono sempre più utilizzati per la produzione di alimenti, biocarburanti 6, elettricità 7 e industriali composti 8, a causa della loro altaghly efficiente conversione di acqua e CO 2 alla biomassa utilizzando l'energia solare 9. Molte specie possono essere coltivate su terreni non coltivabili con sostanze nutritive minime e acqua di mare, il che suggerisce che i cianobatteri potenzialmente potrebbero essere coltivate su larga scala senza compromettere la produzione agricola. Alcune specie sono anche fonti di prodotti naturali, tra cui antifungini, antibatteriche e anti-cancro composti 10,11.
La capacità di generare mutanti è la chiave per comprendere la fotosintesi cianobatteri, biochimica e fisiologia, ed essenziale per lo sviluppo di ceppi per uso industriale. La maggior parte degli studi pubblicati generi geneticamente ceppi modificati mediante inserimento di una cassetta di resistenza antibiotica nel sito di interesse. Ciò limita il numero di mutazioni che possono essere introdotte in un ceppo, come solo alcune cassette di resistenza agli antibiotici sono disponibili per l'uso in cianobatteri. I ceppi che contengono geni che conferiscono re antibioticoresistenza non può essere utilizzato per la produzione industriale in vasche aperte, che rischia di essere l'unico mezzo di costo-efficacia per la produzione di biocarburanti e di altri prodotti a basso valore 12. La generazione di mutanti non marcate supera queste limitazioni. mutanti non marcate non contengono DNA estraneo, se non intenzionalmente incluso, e può essere manipolato più volte. Pertanto è possibile generare come molte modifiche in un ceppo lo desideri. Inoltre, gli effetti polari geni a valle del sito di modifica possono essere minimizzati, consentendo la modifica più precisa dell'organismo 13.
Per generare ceppi mutanti, plasmidi suicidi contenenti due frammenti di DNA identiche alle regioni nel cromosoma cianobatteri che fiancheggiano il gene da cancellare (definito il 5 'e 3' regioni fiancheggianti) sono prima costruiti. Due geni sono poi inseriti tra le regioni fiancheggianti. Uno di questi codifica una proteina resistenza agli antibiotici; il secondo codifica SACB, che produces levansucrasi, un composto che conferisce sensibilità al saccarosio. Nella prima fase del processo, mutanti marcati, cioè ceppi contenenti alcune DNA estraneo, vengono generati. Il costrutto plasmidico è mescolato con le cellule di cianobatteri e il DNA è occupato naturalmente dall'organismo. I trasformanti sono selezionati dalla crescita su piastre di agar contenenti l'antibiotico appropriato e il genotipo mutante verificata mediante PCR. plasmidi suicidio non può replicare entro il ceppo di interesse. Pertanto eventuali colonie resistenti agli antibiotici risulteranno da un evento di ricombinazione per cui il gene di interesse inserito nel cromosoma. Per generare mutanti non marcati, il mutante contrassegnata viene poi mescolato con un secondo plasmide suicida contenente solo i 5 'e 3' regioni fiancheggianti. Tuttavia, se è necessario l'inserimento di DNA estraneo, un plasmide costituito dal 5 'e 3' delle regioni fiancheggianti con cassette contenenti i geni di interesse inserito tra questi frammenti di DNA, può essere utilizzato. Selection è attraverso la crescita su piastre di agar contenenti saccarosio. Come saccarosio è letale per le cellule quando il prodotto genico SACB è espresso, le uniche cellule che sopravvivono sono quelli in cui si è verificato un secondo evento di ricombinazione, per cui il gene sensibilità saccarosio, oltre al gene di resistenza agli antibiotici, è stato ricombinato fuori cromosoma e sul plasmide. Come conseguenza dello scambio ricombinazione, le regioni fiancheggianti e tutte DNA tra loro sono inseriti nel cromosoma.
Abbiamo usato con successo questi metodi per generare mutazioni multiple cromosomiche nello stesso ceppo di Synechocystis sp. PCC6803 (di seguito denominato Synechocystis) 13,14, di introdurre mutazioni puntiformi singoli in un gene di interesse e 13 per l'espressione di cassette geniche. Mentre la generazione di fori non marcati è stata dimostrata prima del nostro lavoro in Synechocystis 15,16, un metodo dettagliato, aiutato dauna presentazione visiva delle fasi critiche, non è a disposizione del pubblico. Abbiamo inoltre applicato lo stesso metodo per la generazione di fori evidenziati in un altro modello cianobatterio, Synechococcus sp. PCC7002 (di seguito denominato Synechococcus). Questo protocollo fornisce una chiara, semplice metodo per la generazione di mutanti e un rapido protocollo per la validazione e la memorizzazione di questi ceppi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passi più critici nella generazione di mutanti non contrassegnate sono: 1) un'attenta progettazione plasmide per garantire solo la regione di destinazione è alterata; 2) garantire che i campioni rimangano axeniche, soprattutto quando coltivate su saccarosio; 3) placcatura cellule per la generazione di mutanti marcati trasformato inizialmente su piastre di agar BG11 privi antibiotici, seguita da aggiunta di agar più antibiotici 24 ore successive; 4) la coltura segnato mutanti per 4 giorni interi prima di placcat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati alla Environmental Services Association Education Trust, la biologia sintetica a Cambridge fondo Synbio e il Ministero della giustizia sociale e responsabilizzazione, Governo dell'India, per il sostegno finanziario.
Materials
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 mL conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 mL round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
References
- Zwirglmaier, K., et al. Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes. Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).
- Galloway, J. N., et al. Nitrogen cycles: past, present, and future. Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).
- Lea-Smith, D. J., et al. Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).
- Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. The origin of plastids. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).
- Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- McCormick, A. J., et al. Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system. Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).
- Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems. Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).
- Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. Engineering cyanobacteria to generate high-value products. Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).
- Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels. Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).
- Tan, L. T. Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery. Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).
- Volk, R. B., Furkert, F. H. Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth. Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).
- Scott, S. A., et al. Biodiesel from algae: challenges and prospects. Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity. Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).
- Lea-Smith, D. J., et al. Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities. Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).
- Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).
- Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 – Consequences for pigment biosynthesis and accumulation. J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).
- Castenholz, R. W. Culturing methods for Cyanobacteria. Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).
- Mitschke, J., et al. An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).
- Ried, J. L., Collmer, A. An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis. Gene. 57, 239-246 (1987).
- Vieira, J., Messing, J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 19, 259-268 (1982).
- Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).
- Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).
- Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002. J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).
- Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803. Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).
- Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria. Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).
- Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium. Appl Environ Microbiol. , (2015).
