Geração de mutantes sem marcadores marcados e no modelo de cianobactérias da espécie

Resumo

A introdução de múltiplas alterações genômicas em cianobactérias é uma ferramenta essencial no desenvolvimento de cepas para fins industriais e de pesquisa básica. Descrevemos um sistema para geração de mutantes não marcados na espécie modelo de cianobactéria Synechocystis sp. PCC6803 e mutantes marcados em Synechococcus sp. PCC7002.

Resumo

As cianobactérias são organismos ecologicamente importantes e plataformas potenciais para a produção de biocombustíveis e produtos industriais úteis. A manipulação genética de cianobactérias, especialmente organismos modelo como Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7002, é uma ferramenta fundamental para pesquisa básica e aplicada. A geração de mutantes não marcados, por meio da qual alterações cromossômicas são introduzidas em uma cepa por meio da inserção de um de resistência a antibióticos (um fragmento manipulável de DNA contendo um ou mais genes), seguido pela remoção subsequente desse usando um marcador selecionável negativo, é uma técnica particularmente poderosa. Mutantes não marcados podem ser manipulados geneticamente repetidamente, permitindo que quantas alterações sejam introduzidas em uma cepa conforme desejado. Além disso, a ausência de genes que codificam proteínas de resistência a antibióticos na cepa mutada é desejável, pois evita a possibilidade de 'fuga' de organismos resistentes a antibióticos para o meio ambiente. No entanto, métodos detalhados para rodadas repetidas de manipulação genética de cianobactérias não são bem descritos na literatura científica. Aqui, fornecemos uma descrição abrangente dessa técnica, que usamos com sucesso para gerar mutantes com deleções múltiplas, mutações de ponto único dentro de um gene de interesse e inserção de novos de genes.

Introdução

As cianobactérias são um filo antiga e diversificada evolutivamente de bactérias encontradas em quase todos ambiente natural na Terra. Em ecossistemas marinhos são particularmente abundantes e desempenham um papel fundamental em muitos ciclos de nutrientes, sendo responsável por cerca de metade da fixação de carbono ^1, a maioria da fixação de nitrogênio ² e centenas de milhões de toneladas de produção de hidrocarbonetos ³ nos oceanos anualmente. Cloroplastos, a organela responsável pela fotossíntese em algas e plantas eucariótica, são susceptíveis de ter evoluído de uma cianobactéria que foi engolida por um organismo hospedeiro ^4....

Protocolo

1. Preparação de Meios de Cultura

1. Preparar o meio de acordo com a BG11 Castenholz, 1988 ^17.
   1. Preparar soluções estoque de BG11 100x, oligoelementos e estoque de ferro (Tabela 1).
   2. Prepare soluções separadas de partida de fosfato, Na ₂ CO ₃ estoque, N - [Tris (hidroximetil) metil] -2-aminoetanossulfónico (TES) e tampão de NaHCO ₃ (Tabela 1).
   3. Autoclave o fosfato e Na ₂ CO ₃ stocks. Filtrar-esterilizar tampão TES e _NaHCO3 com 0,2 mm filtros.
   4. Prepare BG11 através da combinação de 976 ml de água, 10 ml de 1....

Resultados

O plasmídeo concepção é crítica para a geração bem sucedida de ambos os mutantes marcadas e não marcadas. A Figura 1 dá um exemplo do plasmídeo A e B usadas para gerar um mutante de deleção nos genes de Synechocystis cpcC1 e cpcC2 ^13. Em cada caso, as regiões f lanqueadoras 5 'e 3' são aproximadamente 900-1.000 pb. flanqueando reduzidas pode ser utilizado, embora o menor temos testadas com sucesso tem sido aproximadamente 500.......

Discussão

Os passos mais críticos na geração de mutantes não marcados são: 1) um projeto cuidadoso plasmídeo para garantir que apenas a região de destino é alterada; 2) garantir que as amostras permanecem axênico, especialmente quando cultivadas em sacarose; 3) para a geração de células chapeamento mutante marcada inicialmente transformado em placas de agar BG11 falta antibióticos, seguido por adição de ágar antibióticos mais 24 horas mais tarde; 4) cultura marcada mutantes para 4 dias completos antes de plaqueamento em BG11 além.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaNO3	Sigma	S5506
MgSO4.7H2O	Sigma	230391
CaCl2	Sigma	C1016
ácido cítrico	Sigma	C0759
Na2EDTA	Fisher	EDT002
H3BO3	Sigma	339067
MnCl2.4H2O	Sigma	M3634
ZnSO4.7H2O	Sigma	Z4750
Na2MoO4.2H2O	Sigma	331058
CuSO4.5H2O	Sigma	209198
Co(NO3)2.6H2O	Sigma	239267
Citrato de amônio férrico	Sigma	F5879
K2HPO4	Sigma	P3786
Na2CO3	Fisher	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO3	Fisher	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
cianocobalamina	Sigma	47869
Na2S2O3	Sigma	72049
Ágar Bacto	BD	214010
Sacarose	Fisher	SUC001
Placa de Petri 90 mm com ventilação tripla	Greiner	633185
0,2 µ filtros m	Sartorius	16534
Frascos cônicos de 100 ml	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38  m	Bemis	FIL003
Phusion DNA polimerase de alta fidelidade	Phusion	F-530
Agarose	Melford	MB1200
	MoBio	12100-300
Endonucleases de restrição	NEB
T4 ligase	Thermo Scientific	EL0011
Luria Bertani caldo	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Sulfato de canamicina	Sigma	60615
Ampicilina	Sigma	A9518
Kit miniprep de plasmídeo GeneJET	Thermo Scientific	K0503
14 ml tubo de fundo redondo	BD falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA polimerase	Promega	M7805
425-600 µ m contas de vidro	Sigma	G8772
Glicerol	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Lâmpadas fluorescentes	Gro-Lux	69
HT multitron fotobiorreator	Infors

Kit de purificação de DNA