Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성
Summary
이 프로토콜은 효율적으로기도에게 상피 세포를 성숙 마우스 배아 줄기 세포 유래 최종 내배엽 지시합니다. 분화 기술은 정의 된 무 혈청 배양 환경에서, 폐 계통 사양을 직접 3 차원 decellularized 폐 지지체를 사용한다.
Abstract
폐 혈통 차별화는 성장 인자 신호 전달, 세포 – 세포 상호 작용 및 세포 – 기질 상호 작용을 포함하는 복잡한 환경 단서의 통합이 필요합니다. 이 때문에 복잡성, 체외에서 폐 개발의 재현부는 도전 된 폐 상피 세포로 줄기 세포의 분화를 촉진합니다. 이 프로토콜에서, decellularized 폐 비계 줄기 세포 유래기도 상피 세포 폐의 3 차원 환경을 모방하고 생성하기 위해 사용된다. 마우스 배아 줄기 세포는 먼저 decellularized 지지체 상에 시딩 티빈 A를 내배엽 세포와 배아 체 (EB) 배양 방법을 이용하여 내배엽 계통으로 분화 최대 21 일 동안 공기 – 액체 계면에서 배양된다. 이 기술은 추가로 성장 인자를 보충하지 않고 작용기도 상피 세포에 접종 세포 (섬 모세포 클럽 세포 및 기저 세포)의 분화를 촉진한다. 이 문화의 설정이 정의되고, serum-무료, 저렴하고 재현성. 제한된 오염이 문화가 아닌 폐 내배엽 계통에서이 있지만,이 프로토콜은기도 상피 인구를 생성하고, 폐포 상피 세포에 상승을 제공하지 않습니다. 이 프로토콜 생성기도 상피는 폐 기관 형성 기간 동안 질병 모델링이나 낭포 성 섬유증과 같은기도 관련 병리의 약물 발견 플랫폼 세포 – 매트릭스 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
폐 혈통에 만능 세포의 감독 차별화는 미세 1, 2에 정확한 신호 이벤트에 따라 달라집니다. 이 때문에 프로세스의 동적 특성으로는 시험 관내에서 폐 기관 형성 정확한 이벤트를 모방하는 도전되었다. 최근보고는 폐 분화 3-8을 달성하기 위해 이차원 문화 수용성 성장 인자로 보충 단계적 혈통 제한 전략을 이용했다. 단계적인 분화 프로토콜에서 다 능성 세포는 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포 여부를 먼저 최종 내배엽 세균 층으로 분화되었다. homeodomain을 포함하는 전사 인자의 발현 NKX2-1 의해 식별 내배엽 세포는이어서, 폐 전구 세포에 후 전방 내배엽 운명에 가압 하였다. 이러한 폐 전구 세포는 더 근위 (기도) 또는 원위부 (폐포) 폐 상피 세포 위스콘신에 차별화 된번째는 성장 인자 보충을 계속했다. 이러한 2 차원 전략 폐 상피 세포를 생성하는 약간의 성공이 있었다 그러나이 불분명 효율 다른 내배엽 계통의 오염 가능성, 3 차원 (3D) 구조의 부족 등 여러 제한이 있고, 일부 경우에 정의 문화 사용 혈청 보충과 함께. decellularized 폐 골격에 능성 또는 분화 세포의 배양은 점점 폐 상피 3,5,6,8,9 구조를 형성하는 시드 세포의 재생 가능성을 평가하기위한 분석법으로 사용된다. 이러한 보고서 문화는 계속 성장 인자 또는 혈청 보충과 비계에 세포를 파종.
폐 개발 환경 단서에 대한 응답으로 분할, 마이그레이션, 유전자 발현 및 개별 세포의 분화를 포함한다. 세포 외 기질 (ECM)는 구조적지지를 제공 할뿐만 아니라, tissu 지시 당 단백질의 격자 인통합하고 이러한 프로세스 10, 11를 조절하여 전자 형태 형성. 더 생체 폐 개발 환경을 모방 내배엽 배양 용 천연 플랫폼 폐 ECM 지지체를 사용함으로써 높은 효율과 재현성으로 설정 정의 된 3 차원 배양 세포 유래기도 상피 줄기 세포를 생성했다.
쥐의 폐 ECM의 발판이 생성 된 탈세 포화뿐만 아니라 마우스 ESC 유래 내배엽 세포에 의해 생성 이후에 이러한 지지체에 접종 하였다. CXCR4 & C-KIT 단백질의 이중 표현은기도 (근위 폐) 전구 세포로 식별됩니다 SOX2 및 NKX2-1 식 모두에 긍정적 인 최종 내배엽 세포의 정체성과 세포를 나타냅니다. 확실한 내배엽 세포는 시험 관내에서 기능적인기도 상피 세포를 생성하는 데 최대 3 주가 용 공기 액체 경계면 (ALI)에서 배양 하였다.
이 프로토콜은 defini의 폐 계통의 분화를 촉진조기 NKX2-1 + / SOX2 + 초기 근위 폐 전구 세포의 출현으로 관찰 칠일뿐만적인의 내배엽. 하루 14 섬모를 포함 등장 문화 성숙한기도 상피 세포 인구의 21 (TUBB4A +), 클럽 (SCGB1A1의 +) 및 기저 (TRP63 +, KRT5 +) 기본 마우스기도에 대한 형태 학적 및 기능적 유사성을 가진 세포. 이 프로토콜은 상피 세포를기도 강인 분화를 달성하기위한 3 차원 매트릭스의 미세 환경의 중요성을 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 다른 보충제와 차별화를 직접 천연 폐 비계를 사용하여 성숙한 ESC 유래기도 상피 세포를 생성합니다. 이 문화의 설정은, 무 혈청, 저렴하고 재현성 정의된다. 기본 차별화 미디어의 어떠한 성장 인자 보충이 필요하지 않습니다. 줄기 세포 유래 폐 상피 세포를 생성 이전에 발행 된 방법은 혈통 제한 3,4,8,18,19을 촉진하는 성장 인자 보충과 2 차원의 전략을 사용하…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그림 1-3에 묘사 된 실험에 사용 된 Nkx2-1의 mcherry의 ESC 박사 Rossant 박사 Bilodeau을 감사드립니다. FACS는 SickKids-UHN 유동 세포 계측법 시설에서 수행되었다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 및 혁신 캐나다 재단 인프라 보조금 (CSCCD)에서 보조금을 운영에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10U/mL heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90U/mL Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200U/mL penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25μg/mL amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05mg/mL ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
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