דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות
Summary
פרוטוקול זה מפנה ביעילות עכבר גזע עוברי תא נגזרות האנדודרם סופי להבשיל דרכי נשימה תא אפיתל. טכניקת בידול זה משתמשת 3 ממדי פיגומי ריאות decellularized לכוון מפרט שושלת ריאות, באווירת התרבות מוגדרת, סרום ללא.
Abstract
בידול שושלת ריאות מחייב שילוב של רמזים סביבתיים מורכבים הכוללים איתות גורם גדילה, תאי תאי אינטראקציות ויחסי גומלין התא-מטריקס. בשל מורכבות זו, חזרה על התפתחות ריאות במבחנה לקדם התמיינות תאי גזע לתאי האפיתל ריאות כבר מאתגר. בפרוטוקול זה, פיגומים ריאות decellularized משמשים לחקות את הסביבה 3-מימדי של הריאה וליצור תאים בדרכי הנשימה אפיתל גזע תאים שמקורם. תאי גזע עוברי עכבר הם מובחנים ראשונים בשושלת endoderm באמצעות גוף embryoid (EB) שיטת תרבות עם תאי האנדודרם Activin א אז הם זורעים על פיגומי decellularized ותרבותי על ממשק אוויר נוזלי עד 21 ימים. טכניקה זו מקדמת בידול של תאים שנזרעו לתאי האפיתל בדרכי נשימה תפקודיות (תאי ריסים, תאי מועדון, ותאי הבזליים) ללא תוספת גורם צמיחה נוספת. התקנת תרבות זו מוגדרת, Seruמ 'חופשי, זול, לשחזור. למרות שיש זיהום מוגבל משורות endoderm הלא-ריאה בתרבות, פרוטוקול זה רק מייצר אוכלוסיות אפיתל דרכי הנשימה ואינו להצמיח לתאי האפיתל מכתשיים. epithelia Airway שנוצר עם פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות מטריקס התא במהלך organogenesis ריאות עבור מודלים המחלה או פלטפורמות גילוי תרופות של פתולוגיות הקשורות בדרכי הנשימה כגון סיסטיק פיברוזיס.
Introduction
בידול בימוי של תאים פלוריפוטנטיים אל שושלת ריאות תלויה אירועים איתות מדויק במיקרו-סביבה של 1,2. בשל האופי הדינמי של תהליך זה כבר מאתגר לחקות את האירועים המדויקים של organogenesis ריאות במבחנה. הדיווחים אחרונים השתמשו באסטרטגיות הגבלת שושלת חכמת צעד עם תוספת גורם גדילה המסיסה של תרבויות דו ממדים כדי להשיג בידול ריאות 3-8. בפרוטוקולי בידול צעד חכם, תאים פלוריפוטנטיים, אם תאי גזע עובריים (ESC) או תאי גזע מושרים, הובדלו ראשון שכבת ניבט האנדודרם הסופית. תאי Endodermal מכן נדחפו אל גורל endoderm קדמי ואילך כדי ובתאים ריאות, כפי שהוגדרו על ידי הביטוי של NKX2-1 גורם שעתוק המכיל homeodomain. אבות ריאות אלה הובדלו נוספים הפרוקסימלית (דרך נשימה) או דיסטלי (alveolar) לתאי האפיתל ריאות wiה המשיכה תוספת גורם גדילה. 2-ממד אסטרטגיות כאלה היו כמה הצלחה ביצירת תאי אפיתל ריאות, אולם ישנם מספר מגבלות כולל יעילות ברורה, זיהום אפשרי משורות endodermal אחרות, חוסר מבנה 3-ממדי (3D), ובחלק ממקרים להשתמש תרבויות מוגדרות עם תוספת בסרום. תרבות של pluripotent או תאים מובחנים על פיגומי ריאות decellularized משמשת יותר ויותר כמו assay כדי להעריך את פוטנציאל ההתחדשות של תאי זרע להרכיב מבני ריאות אפיתל 3,5,6,8,9. תרבות דוחות כאלה זורעים תאים על פיגומים עם גורם הגדילה המשך או בתוספים בסרום.
פיתוח ריאות כרוכה החלוקה, הגירה, ביטוי גנים והתמיינות של תאים בודדים בתגובה לגירויים סביבתיים. המטריצה הסלולר הנוספת (ECM) היא סריג של גליקופרוטאינים כי בנוסף לספק תמיכה מבנית, מפנה tissuדואר morphogenesis ידי שילוב והסדרת תהליכים אלה 10,11. באמצעות פיגום ECM הריאות כפלטפורמה טבעית לתרבות endoderm טוב יותר לחקות את המילייה התפתחותי in vivo הריאות, יצרנו תאי גזע אפיתל דרכי נשימת תאים שמקורם בתוך 3D-תרבות מוגדרת הגדרה ביעילות שחזור גבוהות.
פיגומי ECM עכברוש ריאות נוצרו על ידי decellularization וכן עכבר ESC שמקורם בתאי endodermal נוצרו ובהמשך זורעים על פיגומים אלה. ביטוי כפול של CXCR4 & חלבוני c-KIT מסמן זהות תא האנדודרם סופית ותאי חיובי לשני Sox2 & ביטוי NKX2-1 המזוהים דרכי נשימה (ריאות הפרוקסימלי) ובתאים. תאי האנדודרם מכריעים היו בתרבית בשעת ממשק נוזל האוויר (ALI) לתקופה של עד שלושה שבועות כדי לייצר תאי אפיתל דרכי נשימה פונקציונלית במבחנה.
פרוטוקול זה מקדם בידול שושלת ריאות של definiendoderm מופרזת מוקדם ככל 7 ימים, ציין עם הופעתה של NKX2-1 + / Sox2 + אבות ריאות הפרוקסימלי מוקדם. במשך היום 14 ו -21 של אוכלוסיות תאי אפיתל דרכי הנשימה בוגרות תרבות לצוץ כולל ריסים (TUBB4A +), מועדון (SCGB1A1 +), ואת בסיס (TRP63 +, KRT5 +) תאים עם דמיון מורפולוגית ופונקציונלי כדי איירווייז עכבר ילידים. פרוטוקול זה מדגים את החשיבות של microenvironment 3D-מטריקס להשגת בידול חזק כדי Airway לתאי האפיתל.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מייצר epithelia דרכי נשימת ESC נגזרת בוגר באמצעות פיגומי ריאות טבעיות רק כדי לכוון בידול ללא השלמה אחרת. התקנת תרבות זו מוגדרת, סרום ללא, זול, לשחזור. ללא השלמה גורמת גדילה של תקשורת בידול הבסיס נדרשת. בעבר שיטות שפורסמו להפקת תאי אפיתל ריאות תאים שמקור?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מבקשים להודות לד"ר Rossant וד"ר Bilodeau עבור ESC mCherry Nkx2-1 השתמש בניסויים מתוארים איורים 1-3. FACS בוצע במתקן cytometry זרימת SickKids-פתאום?. עבודה זו נתמכה על ידי הפעלת מענקים מהמוסד הקנדי לבריאות מחקר ומענק תשתית (CSCCD) מן הקרן הקנדית של חדשנות.
Materials
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10U/mL heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90U/mL Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200U/mL penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25μg/mL amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05mg/mL ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
