Генерация ESC происхождения мыши эпителиальных клеток дыхательных путей с использованием легких Decellularized Строительные леса
Summary
Этот протокол эффективно направляет эмбриональных стволовых клеток мыши, полученных окончательное энтодермы для зрелых эпителиальных клеток дыхательных путей. Эта методика дифференциации использует 3-мерные decellularized каркасы легких направить спецификации клонов легких, в определенной, не содержащей сыворотки настройки культуры.
Abstract
Lung родословная дифференциация требует интеграции сложных экологических сигналов, которые включают в себя передачу сигналов фактора роста, межклеточных взаимодействий и клетка-матрица взаимодействий. Из – за этой сложности, рекапитуляцию развития легких в пробирке способствовать дифференциации стволовых клеток в легких эпителиальных клеток было сложной задачей. В этом протоколе decellularized подмости легочные используются для имитации 3-мерную среду легкого и генерировать полученной из культур клеток эпителиальных клеток дыхательных путей стволовых клеток. Эмбриональных стволовых клеток мыши сначала дифференцированы в энтодермы линии с использованием метода культуры эмбриоидного тела (EB) с энтодермы клетками активина A. Затем высевали на decellularized подмостей и культивировали при воздушно-жидкостной интерфейс на срок до 21 дней. Этот метод способствует дифференциации посеянных клеток к функциональным эпителиальных клеток дыхательных путей (реснитчатые клетки, клубные клетки и базальных клеток) без дополнительного добавок фактора роста. Эта установка культуры определяется, Серум-свободный, недорогой и воспроизводимым. Хотя существует ограниченное загрязнение от не-легочных энтодермальных линий в культуре, этот протокол генерирует только в дыхательных путях эпителиальные населения и не приводят к гиперплазии эпителиальных клеток. Эпителий дыхательных путей, генерируемые с этим протоколом могут быть использованы для изучения клеточной матрицы взаимодействий во время органогенеза легких и для моделирования заболевания или наркотиков обнаружения платформ дыхательных патологий, таких как кистозный фиброз.
Introduction
Направленной дифференцировки плюрипотентных клеток к линии легкого зависит от точных сигнальных событий в микросреде 1,2. Из – за динамической природы этого процесса он был сложным , чтобы имитировать точные события органогенеза легких в лабораторных условиях . Последние отчеты использовали пошаговый стратегии ограничения родословная с фактором роста растворимы добавок двумерных культур для достижения дифференциации легких 3-8. В ступенчатых протоколов дифференцировки, плюрипотентные клетки, то ли эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, были впервые дифференцированы к окончательному энтодермы зародышевого слоя. Энтодермальная клетки впоследствии доводятся до передней энтодермы судьбы, а затем к клеткам-предшественников легких, которые, как определено выражением гомеодоменовым содержащих фактора транскрипции NKX2-1. Эти клетки-предшественники легких были дополнительно дифференцированы проксимальных (дыхательные пути) или дистальных (альвеолярных) эпителиальных клетках легких Wiго фактора роста по-прежнему добавок. Такие 2-мерные стратегии имели некоторый успех в создании легких эпителиальных клеток, однако есть несколько ограничений, включая неясными эффективности, возможного загрязнения от других энтодермальных линий, отсутствие 3-мерного (3D) структуры, а в некоторых случаях использование неопределенных культур с добавками сыворотки. Культура плюрипотентные или дифференцированных клеток на decellularized каркасах легких все чаще используется в качестве анализа для оценки регенеративный потенциал посеянных клеток в формировании легочных эпителиальных структур 3,5,6,8,9. Такие отчеты культуры высевали клетки на каркасах с продолжающимся фактором роста или сыворотки добавок.
Развитие легкого включает в себя разделение, миграцию, экспрессию генов и дифференцировки отдельных клеток в ответ на сигналы окружающей среды. Внеклеточного матрикса (ЕСМ) является решетчатой гликопротеинов, которые в дополнение к обеспечению структурной поддержки, направляет Tissuе формообразование путем интеграции и регулирования этих процессов 10,11. При использовании ECM легких строительных лесов в качестве естественной платформой для энтодермы культуры , чтобы лучше имитировать в естественных условиях легких среду развития, мы сгенерировали стволовых клеток , полученных эпителиальных клеток дыхательных путей в определенной 3D-культуры настройки с высокой эффективностью и воспроизводимостью.
Крыса легких ECM каркасы были сгенерированы decellularization, а также мышь ESC-полученных энтодермальных клеток были получены и впоследствии высевали на этих каркасах. Двойное выражение CXCR4 & C-KIT белков указывает на окончательную идентичность клеток энтодермы и клеток положительный результат как для SOX2 и экспрессии NKX2-1 идентифицированы как клетки в дыхательных путях (проксимальная легких) предшественниках. Definitive энтодермальные клетки культивировали при воздушной жидкости интерфейс (ALI) на срок до трех недель для создания функциональной эпителиальных клеток дыхательных путей в пробирке.
Этот протокол способствует легких клонов дифференциации опреденый энтодерма уже 7 дней, наблюдаемые с появлением NKX2-1 + / + SOX2 ранние проксимальных клеток – предшественников легких. На 14 -й день и 21 культуры популяций зрелых клеток в дыхательных путях эпителиальных появляются , в том числе ресничного (TUBB4A +), клуб (SCGB1A1 +) и базальных (TRP63 +, KRT5 +) клеток с морфологической и функциональной схожести с носителями дыхательных путей мыши. Этот протокол демонстрирует важность 3D-матрицы микросреды для достижения надежной дифференциации для эпителиальных клеток дыхательных путей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, генерирует зрелый эпителий ESC полученные в дыхательных путях, используя только каркасы природного легкого направлять дифференцировку без других добавок. Эта установка культура определяется, не содержащей сыворотки, недорогой и воспроизводимым. Ни один факт…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д – ра Rossant и доктора Bilodeau для mcherry ESC Nkx2-1 , используемых в экспериментах , изображенных на рисунках 1-3. FACS проводили в SickKids-UHN проточной цитометрии фонда. Эта работа была поддержана операционной гранты от Канадского института исследований в области здравоохранения и грант инфраструктуры (CSCCD) из Канадского фонда инноваций.
Materials
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10U/mL heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90U/mL Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200U/mL penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25μg/mL amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05mg/mL ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
