Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers
Summary
Dit protocol richt efficiënt muis embryonale stamcellen afgeleide definitieve endoderm aan de luchtwegen rijpen epitheelcellen. Deze differentiatie techniek maakt gebruik van 3-dimensionale cellen ontdane long scaffolds rechtstreekse long lijn specificatie, in een gedefinieerd serumvrij cultuurmedium setting.
Abstract
Lung lineage differentiatie vereist de integratie van complexe omgevingssignalen dat groeifactor signaaltransductie, cel-cel interacties en cel-matrix interacties omvatten. Door deze complexiteit, herhaling van longontwikkeling in vitro differentiatie van stamcellen long epitheelcellen bevorderen is een uitdaging. In dit protocol wordt gedecellulariseerde long scaffolds gebruikt om de 3-dimensionale omgeving nabootsen van de long en het genereren van stamcellen afgeleide epitheelcellen. Muis embryonale stamcel eerst gedifferentieerd om de endoderm lijn met een embryoid body (EB) kweekmethode met activine A. Endoderm cellen worden vervolgens gezaaid op ontceld steigers en gekweekt bij lucht-vloeistof-grensvlak tot 21 dagen. Deze techniek bevordert differentiatie van gezaaide cellen functionele epitheelcellen (haarcellen, club cellen en basale cellen) zonder bijkomende groeifactor suppletie. Deze cultuur setup is gedefinieerd, Serum-vrij, goedkoop en reproduceerbaar. Hoewel er weinig vervuiling van niet-long endoderm lineages in cultuur, dit protocol genereert alleen luchtwegepitheelcellen populaties en niet leidt tot alveolaire epitheelcellen geven. Luchtwegepitheel die met dit protocol kan worden gebruikt om cel-matrix interacties te bestuderen bij long organogenese en ziektemodel of drug-ontdekkingsplatformen van luchtwegen pathologieën zoals cystische fibrose.
Introduction
Gerichte differentiatie van pluripotente cellen aan de long lijn afhankelijk is nauwkeurig signaleringsgebeurtenissen in de micro 1,2. Vanwege de dynamische aard van dit proces is een uitdaging om de precieze gebeurtenissen long organogenese bootsen in vitro. Recente rapporten hebben stapsgewijze lijn beperking strategieën oplosbare groeifactor aanvulling van tweedimensionale culturen gebruikt long differentiatie 3-8 bereiken. Bij stapsgewijze differentiatie protocollen pluripotente cellen of embryonale stamcellen (ESC) of geïnduceerde pluripotente stamcellen werden eerst gedifferentieerd om de definitieve endoderm kiemlaag. Endodermale cellen werden vervolgens geduwd om een anterieure endoderm lot en daarna naar de longen stamcellen, zoals aangegeven door de expressie van homeodomein bevatten transcriptiefactor NKX2-1. Deze long voorlopers werden verder gedifferentieerd om proximale (de luchtwegen) of distale (alveolaire) long epitheelcellen with aanhoudende groei factor suppletie. Dergelijke 2-dimensionale strategieën hebben enig succes in het genereren longepitheelcellen had, maar er zijn verschillende beperkingen zoals duidelijk efficiëntie mogelijke verontreiniging van andere endodermale lineages, ontbreken van een 3-dimensionaal (3D) structuur en in sommige gevallen het gebruik van ongedefinieerde culturen met serum supplementatie. Cultuur van pluripotente of gedifferentieerde cellen op cellen ontdane long stellages wordt steeds meer gebruikt als een test om de regeneratieve mogelijkheden van gezaaide cellen voor het vormen longepitheelcellen structuren 3,5,6,8,9 beoordelen. Dergelijke rapporten cultuur gezaaide cellen op steigers met een aanhoudende groei factor of serum suppletie.
Longontwikkeling omvat de afdeling, migratie, genexpressie en differentiatie van individuele cellen als reactie op omgevingsfactoren. De extracellulaire matrix (ECM) is een rooster van glycoproteïnen die naast het verstrekken van structurele ondersteuning, verbindt tissue morfogenese door de integratie en de regulering van deze processen 10,11. Via de longen ECM skelet als natuurlijk bruggenhoofd endoderm cultuur beter bootsen de in vivo ontwikkeling longen milieu, hebben we gegenereerd stamcellen afgeleide epitheelcellen in een gedefinieerde 3D-kweek omgeving met hoge efficiëntie en reproduceerbaarheid.
Ratlong ECM scaffolds werden gegenereerd door ontcelling en muis ESC-afgeleide endodermale cellen werden gegenereerd en vervolgens gezaaid op deze scaffolds. Dual expressie van CXCR4 & c-KIT eiwitten duidt op een definitieve endoderm cel identiteit en cellen positief voor zowel SOX2 & NKX2-1 expressie worden geïdentificeerd als de luchtwegen (proximale long) stamcellen. Definitieve endoderm cellen werden gekweekt bij Air Liquide interface (ALI) gedurende drie weken functionele epitheelcellen in vitro genereren.
Dit protocol bevordert long lineage differentiatie van definitieve endoderm zo vroeg als 7 dagen, waargenomen met de opkomst van NKX2-1 + / SOX2 + vroege proximale long voorouders. Op dag 14 en 21 van de cultuur volwassen luchtwegen epitheelcellen populaties emerge waaronder trilharen (TUBB4A +), club (SCGB1A1 +), en basale (TRP63 +, KRT5 +) cellen met morfologische en functionele gelijkenis met inheemse muis luchtwegen. Dit protocol toont het belang van de 3D-matrix micro-omgeving voor het bereiken robuuste differentiatie epitheelcellen van de luchtwegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocol genereert volwassen ESC-afgeleide luchtwegepithelen met uitsluitend natuurlijke long steigers aan direct differentiatie met geen andere suppletie. Deze cultuur setup is gedefinieerd, serumvrij, goedkoop en reproduceerbaar. Geen groeifactor suppletie base differentiatie media vereist. Eerder gepubliceerde werkwijzen voor het genereren stamcellen afgeleide longepitheelcellen gebruikt 2-dimensionale strategieën groeifactor suppletie van afstamming beperking 3,4,8,18,19 promoten. De h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Dr. Rossant en Dr. Bilodeau bedanken voor de Nkx2-1 mCherry ESC gebruikt in experimenten afgebeeld in figuren 1-3. FACS werd uitgevoerd in De SickKids-UHN flowcytometrie Facility. Dit werk werd ondersteund door het bedienen van subsidies van de Canadese Institutes for Health Research en een infrastructuur subsidie (CSCCD) van de Canadese Stichting voor Innovatie.
Materials
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10U/mL heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90U/mL Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200U/mL penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25μg/mL amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05mg/mL ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
