جيل من خلايا الفأر مجرى الهواء طلائي المشتقة ESC عن طريق Decellularized الرئة السقالات
Summary
هذا البروتوكول توجه بكفاءة الماوس الجذعية الجنينية المستمدة من الخلايا الأديم الباطن نهائي لتنضج الهوائية الخلايا الظهارية. ويستخدم هذا الأسلوب التمايز 3-الأبعاد السقالات الرئة decellularized لتوجيه مواصفات النسب الرئة، في إطار ثقافة محددة، خالية من المصل.
Abstract
الرئة النسب التمايز يتطلب تكامل منبهات البيئية المعقدة التي تشمل عامل النمو الإشارات، والتفاعلات خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة. بسبب هذا التعقيد، خلاصة التنمية الرئة في المختبر لتعزيز تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا الظهارية الرئة قد التحدي. في هذا البروتوكول، وتستخدم السقالات الرئة decellularized لمحاكاة بيئة 3-الأبعاد في الرئة وتوليد الخلايا الجذعية الهوائية الظهارية المستمدة من الخلية. يتم التمييز الماوس الخلايا الجذعية الجنينية أول من سلالة الأديم باستخدام أسلوب الثقافة الجسم مضغي (EB) مع activin A. خلايا الأديم ثم تبذر على سقالات decellularized والمثقف في واجهة الهواء السائل لمدة تصل إلى 21 يوما. هذا الأسلوب يعزز تمايز الخلايا المصنف إلى الخلايا الظهارية مجرى الهواء وظيفي (خلايا مهدبة، وخلايا النادي، والخلايا القاعدية) دون إضافية مكملات عامل النمو. يتم تعريف الإعداد الثقافة هذه، سيرووغير مكلفة، وقابلة للتكرار خالية من م. بالرغم من وجود تلوث محدود من الأنساب الأديم غير الرئة في الثقافة، وهذا البروتوكول يولد سوى مجرى الهواء السكان الظهارية ولا تؤدي إلى الخلايا الظهارية السنخية. ظهائر الهوائية ولدت مع هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات خلية مصفوفة خلال توالد الرئتين والنمذجة المرض أو منصات اكتشاف المخدرات من الأمراض ذات الصلة الهوائية مثل التليف الكيسي.
Introduction
التمايز الموجهة من الخلايا المحفزة لنسب الرئة يعتمد على أحداث إشارات دقيقة في المكروية 1،2. ويرجع ذلك إلى الطبيعة الديناميكية لهذه العملية فقد كان تحدي لتقليد أحداث دقيقة من توالد الرئة في المختبر. وقد استخدمت التقارير الأخيرة استراتيجيات تقييد النسب تدريجي مع نمو قابل للذوبان عامل مكملات الثقافات ثنائية الأبعاد لتحقيق التمايز الرئة 3-8. في بروتوكولات التمايز خطوة حكيمة، الخلايا المحفزة، ما إذا كانت الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) أو التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة، ومتباينة أولا إلى طبقة الأديم الجرثومية نهائية. وقد دفعت خلايا الأديم الباطن في وقت لاحق إلى مصير الأديم الأمامي، وبعد ذلك إلى الخلايا الاولية الرئة، كما حددها التعبير المحتوية على homeodomain عامل النسخ NKX2-1. والتفرقة بين هذه الأسلاف الرئة أيضا على الأقرب (الهوائية) أو البعيدة (السنخية) خلايا الظهارية الرئة واياستمرت عشر عامل النمو مكملات. وكان هذه الاستراتيجيات 2-الأبعاد بعض النجاح في توليد خلايا الظهارية الرئة، ولكن هناك العديد من القيود بما في ذلك الكفاءة غير واضحة، وتلوث محتمل من الأنساب الأديم الباطن أخرى، عدم وجود (3D) هيكل 3-الأبعاد، وفي بعض الحالات تستخدم الثقافات غير محددة مع مكملات المصل. يستخدم ثقافة المحفزة أو خلايا متباينة على السقالات الرئة decellularized على نحو متزايد باعتبارها فحص لتقييم إمكانات التجدد الخلايا المزروعة في تشكيل الرئة الهياكل الظهارية 3،5،6،8،9. ثقافة هذه التقارير المصنفة الخلايا على السقالات مع استمرار عامل النمو أو مكملات المصل.
ينطوي نمو الرئة تقسيم، والهجرة، والتعبير الجيني وتمايز الخلايا الفردية في الاستجابة للمنبهات البيئية. في نسيج خارج الخلية (ECM) هو التشبيك من بروتينات سكرية أنه بالإضافة إلى توفير الدعم الهيكلي، يوجه TISSUالبريد التشكل من خلال دمج وتنظيم هذه العمليات 10،11. باستخدام سقالة ECM الرئة كمنصة الطبيعية للثقافة الأديم لتقليد أفضل في الجسم الحي الرئة الوسط التنموي، ونحن قد ولدت وقف الهوائية الخلايا الظهارية المشتقة من خلية في 3D ثقافة محددة مع وضع كفاءة عالية والتكاثر.
تم إنشاؤها الفئران الرئة السقالات ECM التي كتبها decellularization وكذلك خلايا الأديم الباطن المشتقة ESC الفأر تم إنشاؤها والمصنف في وقت لاحق على هذه الاطر. التعبير المزدوج للCXCR4 والبروتينات ج-KIT يشير إلى هوية محددة خلية الأديم الباطن وخلايا إيجابية لكلا SOX2 والتعبير NKX2-1 تم تعريفها على أنها خلايا الشعب الهوائية (الرئة الداني) السلف. كانت خلايا الأديم نهائية مثقف في واجهة الهواء السائل (علي) لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع لتوليد الخلايا الظهارية مجرى الهواء وظيفي في المختبر.
هذا البروتوكول يعزز الرئة النسب تمايز definiTIVE الأديم الباطن في وقت مبكر من 7 أيام، لاحظ مع ظهور NKX2-1 + / + SOX2 مبكرة الأسلاف الرئة القريبة. يوم 14 و 21 من ثقافة ناضجة السكان الخلية الهوائية الظهارية ستخرج بما مهدبة (TUBB4A +) ونادي (SCGB1A1 +)، والقاعدية (TRP63 +، KRT5 +) الخلايا مع تشابه الصرفي والوظيفي لشركة الخطوط الجوية الماوس الأم. يوضح هذا البروتوكول على أهمية المكروية 3D مصفوفة لتحقيق التمايز قوي لمجرى الهواء الخلايا الظهارية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يولد ناضجة ظهائر الهوائية المستمدة ESC باستخدام السقالات الرئة الطبيعية الوحيدة لتوجيه تمايز مع عدم وجود مكملات أخرى. يتم تعريف الإعداد الثقافة هذه، وغير مكلفة، وقابلة للتكرار خالية من المصل. لا يلزم عامل النمو مكملات من وسائل الاعلام قاعدة الت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور Rossant والدكتور Bilodeau لESC mcherry Nkx2-1 المستخدمة في التجارب يصور في أرقام 1-3. تم تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية في مرفق SickKids-UHN التدفق الخلوي. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة ومنحة البنية التحتية (CSCCD) من المؤسسة الكندية للابتكار التشغيل.
Materials
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10U/mL heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90U/mL Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200U/mL penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25μg/mL amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05mg/mL ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
