ईएससी व्युत्पन्न माउस श्वासनली उपकला decellularized फेफड़े Scaffolds का उपयोग कोशिकाओं की पीढ़ी
Summary
इस प्रोटोकॉल कुशलता माउस भ्रूणीय स्टेम सेल व्युत्पन्न निश्चित एण्डोडर्म निर्देशन एयरवे उपकला कोशिकाओं परिपक्व करने के लिए। यह भेदभाव तकनीक 3 आयामी decellularized फेफड़ों मचानों का उपयोग करता है फेफड़ों के वंश विनिर्देश को निर्देशित करने के लिए, एक परिभाषित, सीरम मुक्त संस्कृति की स्थापना में।
Abstract
फेफड़े वंश भेदभाव जटिल पर्यावरण संकेत है कि वृद्धि कारक सिगनल, सेल सेल बातचीत और सेल मैट्रिक्स बातचीत में शामिल हैं के एकीकरण की आवश्यकता है। इस जटिलता के कारण, इन विट्रो में फेफड़ों के विकास का संक्षिप्त फेफड़ों उपकला कोशिकाओं को स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए चुनौती रहा है। इस प्रोटोकॉल में, decellularized फेफड़ों scaffolds फेफड़ों के 3-आयामी वातावरण की नकल और स्टेम सेल व्युत्पन्न एयरवे उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। माउस भ्रूणीय स्टेम सेल पहली activin ए एण्डोडर्म कोशिकाओं के साथ एक embryoid शरीर (ईबी) संस्कृति विधि का उपयोग करने के लिए एण्डोडर्म वंश भेदभाव कर रहे हैं तो decellularized मचानों पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और अप करने के लिए 21 दिनों के लिए हवा तरल इंटरफेस में सुसंस्कृत। इस तकनीक को अतिरिक्त वृद्धि कारक पूरकता के बिना कार्यात्मक एयरवे उपकला कोशिकाओं के लिए वरीयता प्राप्त कोशिकाओं (रोमक कोशिकाओं, क्लब कोशिकाओं, और बेसल सेल) के भेदभाव को बढ़ावा देता है। इस संस्कृति सेटअप परिभाषित किया गया है, Seruमीटर से मुक्त, सस्ती, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य। हालांकि वहां की संस्कृति में गैर फेफड़ों एण्डोडर्म प्रजातियों से सीमित संदूषण है, इस प्रोटोकॉल केवल एयरवे उपकला आबादी उत्पन्न करता है और वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं को जन्म देना नहीं है। श्वासनली इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न epithelia फेफड़ों जीवोत्पत्ति के दौरान और रोग मॉडलिंग या ऐसे सिस्टिक फाइब्रोसिस के रूप में एयरवे संबंधी विकृतियों की दवा की खोज प्लेटफार्मों के लिए सेल मैट्रिक्स बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
फेफड़ों के वंश को pluripotent कोशिकाओं के निर्देशन में भेदभाव microenvironment 1,2 में सटीक संकेत घटनाओं पर निर्भर है। इस प्रक्रिया के गतिशील स्वभाव के कारण यह इन विट्रो में फेफड़ों जीवोत्पत्ति के सटीक घटनाओं की नकल करने की चुनौती दे दी गई है। हाल की रिपोर्टों से दो आयामी संस्कृतियों के घुलनशील वृद्धि कारक पूरकता के साथ कदम वार वंश प्रतिबंध रणनीतियों का इस्तेमाल किया है फेफड़ों भेदभाव 3-8 प्राप्त करने के लिए। कदम वार भेदभाव प्रोटोकॉल में, pluripotent कोशिकाओं, चाहे भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल, पहले निश्चित एण्डोडर्म रोगाणु परत करने के लिए भेदभाव किया गया। Endodermal कोशिकाओं बाद के रूप में homeodomain युक्त प्रतिलेखन कारक NKX2-1 की अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की, फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं को एक पूर्वकाल एण्डोडर्म भाग्य को धकेल दिया गया था और उसके बाद। ये फेफड़ों के पूर्वज आगे समीपस्थ (एयरवे) या बाहर का (वायुकोशीय) फेफड़ों उपकला कोशिकाओं वाई करने के लिए भेदभाव कर रहे थेवें वृद्धि कारक पूरकता जारी रखा। इस तरह 2-आयामी रणनीति है फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं को पैदा करने में कुछ सफलता मिली है, लेकिन वहाँ अस्पष्ट क्षमता, अन्य endodermal प्रजातियों से संभावित संक्रमण, एक 3-आयामी (3 डी) संरचना की कमी सहित कई सीमाएं हैं, और कुछ मामलों में अपरिभाषित संस्कृतियों का उपयोग सीरम पूरकता के साथ। Pluripotent या decellularized फेफड़ों मचानों पर विभेदित कोशिकाओं की संस्कृति तेजी से फेफड़ों के उपकला संरचनाओं 3,5,6,8,9 बनाने में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के पुनर्योजी क्षमता का आकलन करने के लिए एक परख के रूप में प्रयोग किया जाता है। इस तरह की रिपोर्टों संस्कृति निरंतर विकास के कारक या सीरम पूरकता के साथ मचानों पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं।
फेफड़ों के विकास प्रभाग, प्रवास, जीन पर्यावरण cues के जवाब में अभिव्यक्ति और व्यक्ति की कोशिकाओं के भेदभाव शामिल है। अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) ग्लाइकोप्रोटीन की एक जाली कि संरचनात्मक समर्थन प्रदान करने के अलावा, निर्देशन Tissu हैएकीकरण और इन प्रक्रियाओं 10,11 विनियमन द्वारा ई morphogenesis। एण्डोडर्म संस्कृति के लिए एक मंच के रूप में प्राकृतिक फेफड़ों ईसीएम पाड़ का उपयोग कर बेहतर विवो फेफड़ों के विकास के वातावरण की नकल करने से, हम उच्च दक्षता और reproducibility के साथ स्थापित करने के लिए एक परिभाषित 3 डी-संस्कृति में सेल व्युत्पन्न एयरवे उपकला स्टेम कोशिकाओं उत्पन्न किया है।
चूहा फेफड़ों ईसीएम scaffolds decellularization के साथ ही माउस ईएससी व्युत्पन्न endodermal कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न किया गया उत्पन्न किया गया और बाद में इन मचानों पर वरीयता प्राप्त। CXCR4 और सी-किट प्रोटीन की दोहरी अभिव्यक्ति एक निश्चित एण्डोडर्म सेल पहचान और कोशिकाओं दोनों Sox2 और NKX2-1 अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक एयरवे (समीपस्थ फेफड़ों) पूर्वज कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं इंगित करता है। निश्चित एण्डोडर्म कोशिकाओं को तीन सप्ताह के लिए इन विट्रो में कार्यात्मक एयरवे उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए हवा तरल इंटरफेस (अली) में सुसंस्कृत थे।
इस प्रोटोकॉल परिभाषा के फेफड़ों वंश भेदभाव को बढ़ावा देता हैसक्रिय एण्डोडर्म के रूप में जल्दी 7 दिन, NKX2-1 + / Sox2 + जल्दी समीपस्थ फेफड़ों के progenitors के उद्भव के साथ मनाया जाता है। दिन के 14 और संस्कृति परिपक्व एयरवे उपकला सेल आबादी के 21 उभरने रोमक सहित (TUBB4A +), क्लब (SCGB1A1 +), और बेसल (TRP63 +, KRT5 +) मूल निवासी माउस एयरवेज को रूपात्मक और कार्यात्मक समानता के साथ कोशिकाओं द्वारा। इस प्रोटोकॉल उपकला कोशिकाओं airway के लिए मजबूत भेदभाव को प्राप्त करने के लिए 3 डी मैट्रिक्स microenvironment के महत्व को दर्शाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल परिपक्व ईएससी व्युत्पन्न एयरवे केवल प्राकृतिक फेफड़ों मचानों का उपयोग कर कोई अन्य पूरकता के साथ भेदभाव को निर्देशित करने के epithelia उत्पन्न करता है। इस संस्कृति सेटअप, सीरम मुक्त, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Nkx2-1 mCherry आंकड़े 1-3 में चित्रित प्रयोगों में इस्तेमाल ईएससी के लिए डॉ रोसंट और डॉ Bilodeau का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। FACS SickKids-UHN से फ्लो सुविधा में प्रदर्शन किया गया था। इस काम के संचालन के स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए संस्थान कनाडा और नवाचार के कनाडाई फाउंडेशन से एक बुनियादी सुविधाओं अनुदान (CSCCD) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10U/mL heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90U/mL Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200U/mL penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25μg/mL amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05mg/mL ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
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