Generering av MGP-avledet Mouse Airway Epitelceller Bruke Decellularized Lung Stillas
Summary
Denne protokollen dirigerer effektivt mus embryonale stamcelle-avledet definitive endoderm til modne luftveier epitelceller. Denne differensieringen teknikken bruker tre-dimensjonale decellularized lunge stillasene for å dirigere lunge avstamning spesifikasjon, i et definert, serumfritt kultur innstilling.
Abstract
Lunge avstamning differensiering krever integrering av komplekse miljø signaler som omfatter vekstfaktor-signalering, celle-celle interaksjoner og celle-matriks-interaksjoner. På grunn av denne kompleksiteten, til gjentagelse av lunge utvikling in vitro fremme differensiering av stamceller til lunge epitelceller har vært utfordrende. I denne protokollen, decellularized lunge stillasene benyttes for å etterligne den tre-dimensjonale miljøet i lunge og generere stamcelle-avledede luftveis epitelceller. Mus embryonale stamceller blir først differensiert til endoderm linjen ved hjelp av en embryoid legeme (EB) dyrkningsmetode med aktivin A. endoderm Cellene blir deretter sådd ut på decellularized stillaser og dyrket ved luft-væske-grenseflate i opp til 21 dager. Denne teknikken fremmer differensiering av seeded celler til funksjonell Airway epitelceller (Cilierte celler, klubb celler, og basal celler) uten ytterligere vekstfaktor tilskudd. Denne kulturen oppsettet er definert, serum-fri, billig, og reproduserbar. Selv om det er begrenset forurensning fra ikke-lunge endoderm linjene i kultur, denne protokollen genererer bare luftveis epitel populasjoner og ikke gir opphav til alveolære epitelceller. Airway epithelia generert med denne protokollen kan brukes til å studere celle-matriks interaksjoner under lunge organogeneseperioden og for sykdom modellering eller narkotika-discovery plattformer av luftveisrelaterte sykdommer som cystisk fibrose.
Introduction
Regissert differensiering av pluripotente celler til lungene avstamning er avhengig av presise signal hendelser i mikromiljøet 1,2. På grunn av dynamikken i denne prosessen har det vært utfordrende å etterligne de nøyaktige hendelsene i lunge organogeneseperioden in vitro. Nyere rapporter har brukt trinnvise avstamning restriksjons strategier med løselig vekstfaktor tilskudd av to-dimensjonale kulturer for å oppnå lunge differensiering 3-8. I trinn-messig differensiering protokoller, pluripotente celler, enten embryonale stamceller (ESC) eller induserte pluripotente stamceller, ble først differensiert til den definitive endoderm bakterie lag. Endodermal celler ble deretter presset til en fremre endoderm skjebne, og deretter til lunge progenitor-celler, som er identifisert ved ekspresjon av homeodomain-inneholdende transkripsjonsfaktor NKX2-1. Disse lungestamfedre ble ytterligere differensiert i proksimale (luftveier) eller distal (alveolære) lunge epitelceller with fortsatt vekst faktor tilskudd. Slike to-dimensjonale strategier har hatt en viss suksess i å generere lunge epitelceller, men det er flere begrensninger, inkludert uklare effektivitet, mulig forurensning fra andre endodermal slektsnavn, mangel på en tre-dimensjonal (3D) struktur, og i noen tilfeller bruk av udefinerte kulturer med serum tilskudd. Kultur av pluripotent eller differensierte celler på decellularized lungestillasene blir stadig mer brukt som en analyse for å vurdere den regenerative potensialet til utsådd celler til å danne tette epiteliale strukturer 3,5,6,8,9. Slike rapporter kultur seeded celler på stillasene med fortsatt vekstfaktor eller serum tilskudd.
Lunge utvikling involverer divisjonen, migrasjon, genekspresjon og differensiering av individuelle celler i respons til miljømessige signaler. Den ekstra matriks (ECM) er et rammeverk av glykoproteiner som i tillegg til å gi strukturell støtte, dirigerer tissue morphogenesis ved å integrere og regulere disse prosessene 10,11. Ved hjelp av lunge ECM stillaset som en naturlig plattform for endoderm kultur for å bedre etterligne in vivo lunge utviklingsmiljøet, har vi generert stamcelle-avledet luftveis epitelceller i et definert 3D-kultur innstilling med høy effektivitet og reproduserbarhet.
Rat lunge ECM stillasene ble generert av decellularization samt mus ESC-avledet endodermal celler ble generert og deretter sådd ut på disse stillasene. Dual uttrykk for CXCR4 & c-KIT proteiner indikerer en definitiv endoderm celle identitet og positiv for både SOX2 & NKX2-1 uttrykk er identifisert som luftveis (proksimale lunge) stamceller celler. Definitive endoderm celler ble dyrket i luften væske-grensesnittet (ALI) for opptil tre uker å lage funksjonelle Airway epitelceller in vitro.
Denne protokollen fremmer lunge avstamning differensiering av Definitiontive endoderm så tidlig som 7 dager, observert med fremveksten av NKX2-1 + / SOX2 + tidlige proksimale lunge stamfedre. Ved dag 14 og 21 av kultur modne luftveier epiteliale cellepopulasjoner dukker inkludert Cilierte (TUBB4A +), klubb (SCGB1A1 +), og basal (TRP63 +, KRT5 +) celler med morfologisk og funksjonell likhet med innfødte mus luftveiene. Denne protokollen demonstrerer viktigheten av 3D-matrix mikromiljøet for å oppnå robust differensiering til luftveis epitelceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er beskrevet her genererer modne ESC-avledet luftveis epitel med kun naturlig lunge stillasene til direkte differensiering med ingen andre tilskudd. Denne kulturen oppsettet er definert, serum-fri, billig, og reproduserbar. Ingen vekstfaktor tilskudd av basen differensiering media er nødvendig. Tidligere publiserte metoder for å generere stamcelle-avledet lunge epitelceller har brukt to-dimensjonale strategier med vekstfaktor tilskudd for å fremme avstamning begrensning 3,4,8,18,19. Teknikken s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke dr Rossant og Dr. Bilodeau for Nkx2-1 mcherry ESC brukt i eksperimenter vist i figur 1-3. FACS ble utført i Den SickKids-uhn flowcytometrisystemer Facility. Dette arbeidet ble støttet av driftstilskudd fra den kanadiske Institutes for Health Research og en infrastruktur stipend (CSCCD) fra kanadiske Foundation of Innovation.
Materials
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10U/mL heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90U/mL Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200U/mL penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25μg/mL amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05mg/mL ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
